Специалист лаборатории объяснила, почему ПЦР-тесты на коронавирус могут выдавать ошибку
Известно, что результаты ПЦР-теста на коронавирус могут быть как ложноположительными, так и ложноотрицательными. Заведующая лабораторией молекулярной диагностики «Инвитро» в Москве Наталья Гасилова объяснила «Доктору Питеру», какие причины могут повлиять на результат в процессе тестирования.
2 декабря 202065
Ранее в Роспотребнадзоре озвучивали правила, которые необходимо соблюдать пациентам перед тестированием. К примеру, за несколько часов до взятия мазка не рекомендуется есть и пить, пользоваться спреями для горла и носа, а также чистить зубы и красить губы. Всё это, по словам специалистов, может повлиять на правильность результата. Заведующая московской лабораторией молекулярной диагностики «Инвитро» Наталья Гасилова назвала «Доктору Питеру» еще несколько причин, которые могут приводить к выдаче ложных результатов ПЦР-теста.
— Прежде всего, надо определиться с понятиями, — говорит Наталья Гасилова. — Ложноположительный результат — это когда пациент не инфицирован коронавирусом, но лаборатория выдала положительный результат теста на SARS-CoV-2 методом ПЦР. Ложноотрицательный — когда человек на самом деле инфицирован, но лаборатория выдает «-».
Как получают ложноположительные результаты?
Основная причина — так называемая кросс-контаминация, перекрестное загрязнение одного образца содержимым другого. Это может произойти на любом этапе тестирования — взятии мазка, транспортировки или уже в лаборатории.
— Как правило, источником кросс-контаминации служат образцы с большим содержанием РНК вируса в пробе. Тогда для загрязнения достаточно попадания капель или даже аэрозоля с этого образца, — говорит Наталья Гасилова. — Это может произойти в месте взятия мазка, при маркировке образца или пробирки, если медперсонал не меняет грязные перчатки. Есть также требование — оставлять зонд, которым берется биоматериал, в пробирке. Его полагается отламывать или отрезать ножницами. При выполнении этой операции тоже есть риск испачкать перчатки, поэтому их надо каждый раз менять.
По словам специалиста, загрязнение «чистого» образца может случиться и при транспортировке анализов.
— Например, если крышка пробы не плотно закрыта, биоматериал может «подтекать». В итоге пробирка снаружи будет контаминирована и, если потом пробирки ставятся в один штатив и перчатки не меняются, частицы вируса могут «переноситься» в другой образец. Еще такое бывает, когда в пробирке оставляются достаточно крупные зонды. В этом случае крышка микропробирки закрывается с усилием, может периодически приоткрываться, а вытекающие капельки биоматериала опять же попадают на стенку пробирки снаружи, — поясняет медик.
В лаборатории, кроме регулярной смены перчаток, важно аккуратно открывать пробирки — так, чтобы микроаэрозоль из одной пробирки не попал в другую.
— У каждой лаборатории есть алгоритм борьбы с кросс-контаминацией, по каким признакам ее определить и что делать. Самое сложное — контаминация продуктами амплификации или ампликонами (размножение фрагментов нуклеиновых кислот в исследовании ПЦР — Прим. ред.). По сути, это аварийная ситуация, которая требует проведения срочных мер в лаборатории. В этом исследовании ее риск минимален, поскольку пробирка после амплификации не открывается, и ампликоны во внешнюю среду не попадают.
Возможные причины ложноотрицательных результатов
По словам Натальи Гасиловой, здесь основная причина кроется в чувствительности тест-системы, которая применяется в конкретной лаборатории.
— Сейчас большинство производителей выпускают наборы с чувствительностью 1000 копий РНК вируса на 1 миллилитр (1х10*3). Она позволяет выявлять вирус как у бессимптомных и контактных в начале развития инфекции, так и в конце заболевания — уже на этапе выздоровления. Но если в образце количество вируса будет меньше порога чувствительности, то лаборатория выдаст ложноотрицательный результат, — поясняет эксперт.
Еще на результат влияет корректность взятия биоматериала со слизистой оболочки носо- и ротоглотки: к примеру, мазок взяли только из зева, а надо еще и из носа. Повлияет на него также малая вирусная нагрузка в биоматериале — когда тест выполняется в самом начале болезни или, наоборот, практически при выздоровлении, когда вирус уже уходит из организма.
Ложноотрицательный результат можно получить при нарушении рекомендованного срока хранения взятого образца — со временем вирус начинает разрушаться, а его РНК «деградирует». Кстати, согласно 9-й версии временных рекомендаций Минздрава по профилактике и лечению COVID-19, мазок должен храниться до исследования не более 5 дней при температуре от +2° до +8°C или дольше при -20°С или -70°С — Прим. ред.). В то же время, по последним требованиям Роспотребнадзора, срок выполнения теста на выявление РНК SARS-CoV-2 не должен превышать 48 часов с момента взятия мазка.
Общая причина, объясняющая как ложноположительные, так и ложноотрицательные результаты может скрываться в ненадежной системе идентификации образцов.
— Такое возникает, например, когда результаты выдаются в ручном формате, а не поступают в информационную лабораторную систему с приборов автоматически, — объясняет специалист лаборатории. — Это может приводить к нарушениям на постаналитическом этапе исследования, когда пациенту просто выдается чужой результат.
ПЦР-тесты стали золотым стандартом диагностики коронавируса, но из-за высокой стоимости и длительной обработки результатов во многих странах для скрининга широко используют экспресс-тесты на антиген к SARS-CoV-2. Новое исследование показало, что это не самая надежная альтернатива. Результаты опубликованы в JAMA Network.
Тесты на антиген коронавируса распознают его определенные поверхностные белки, они предназначены для диагностики активной инфекции SARS-CoV-2. Основные преимущества тестов на антиген коронавируса перед ПЦР-тестом – скорость получения результата (от 5 до 15 минут), относительная дешевизна и простота, для их проведения не требуется лабораторное оборудование. ВОЗ рекомендует применять экспресс-тесты в случаях, когда ПЦР-тесты недоступны или их нецелесообразно применять из-за долгого времени ожидания результатов.
Чтобы оценить потенциал экспресс-тестов, ученые Университета Торонто проанализировали более 900 тысяч результатов, полученных в период с января по октябрь 2021 года. За этот период в Канаде прошли две крупные волны заболеваемости COVID-19, и тесты на антиген к коронавирусу широко применялись для тестирования работников предприятий.
В общей сложности было выявлено 1322 положительных результата, из них 1103 были подтверждены ПЦР-тестом. По оценкам ученых, 42% результатов были ложно-положительным, то есть человек получил ошибочный диагноз.
По мнению ученых, частично это может быть связано с некорректным проведением теста, однако не менее 60% ложно-положительных результатов произошли из-за низкого качества тест-систем. В частности, 278 ошибочных результатов были получены тестами из бракованной партии.
«Наше исследование дает больше данных для обсуждения вопроса о том, приведут ли экспресс-тесты к слишком большому количеству ложно-положительных результатов, которые могут превысить возможности ПЦР-тестирования в других условиях», — написали ученые. Они подчеркнули, что органы здравоохранения должны создавать комплексную систему для оперативного выявления некачественных и бракованных тестов.
Похожее исследование провели в прошлом году ученые из Австралии, по их оценкам, экспресс-тесты могут давать ложный результат в каждом четвертом случае. Специалисты рекомендовали проявлять осторожность при использовании тестов на антиген к SARS-Cov-2, особенно в уязвимых группах пациентов, и подтверждать положительные результаты ПЦР-тестом.
Как сообщил МедПорталу директор научного центра молекулярно-генетических исследований ДНКОМ Андрей Исаев, точность всех экспресс-тестов оставляет желать лучшего, за исключением тестов на беременность (ХГЧ) и уровень глюкозы. Использовать для домашнего использования наборы, купленные в ближайшей аптеке и принимать решения по их результатам не стоит, считает эксперт.
«Если вы едете в джунгли Амазонки, то экспресс-тест — это лучше, чем ничего. Но по-хорошему они должны применяться только в условиях, когда медицинские сотрудники недоступны или есть неквалифицированные. Поскольку традиционно такие тесты закупали страны Азии и Африки, а производят их в основном в Китае масштабными партиями, многие из них сомнительного качества».
эксперт
Сооснователь и генеральный директор научного центра молекулярно-генетических исследований ДНКОМ
Существует ли различие между частотой ложноотрицательных результатов теста у асимптомных пациентов (более низкая вирусная нагрузка) по сравнению с симптомными пациентами (более высокая вирусная нагрузка)?
Вероятнее всего большее число ложноотрицательных результатов отмечается у асимптомных пациентов с коронавирусной инфекцией. Однако на данный момент не было выполнено крупных исследований, оценивших различия между группами (в том числе, необходимо проанализировать сероконверсию и провести тесты ПЦР).
- Следует отметить, что бессимптомные пациенты могут выделять вирус в высоких титрах В настоящее время серологические лонгитюдные исследования находятся в процессе.
Исследования, выполненные в домах престарелых и круизных лайнерах показали, что значительное количество пациентов имели вирус, культивируемый за 6 дней до появления симптомов.
Позволяют ли доступные в настоящее время тесты различать SARS-CoV-2 и другие коронавирусы, которые могут быть похожими? Как это повлияет на точность и надежность теста?
- Доступные мультипанели тестов ПЦР на респираторные вирусы не определяют SARS-CoV-2. В настоящее время многие компании работают над тем, чтобы включить тест на новый коронавирус в уже имеющиеся панели тестов.
- Тест на ПЦР SARS-CoV-2 не позволяет определить наличие других коронавирусов (HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63 и HCoV-HKU1) или MERS-CoV.
- Нельзя сравнивать доступные в настоящее время тесты на коронавирус ввиду их различной чувствительности и специфичности. Более того, даже если тест имеет специфичность от 96% до 98%, если вероятность претеста COVID-19 составляет <5%, более вероятно, что результат будет ложноположительным, чем истинно положительным — и это одна из ключевых причин почему массовое серологическое тестирование не рекомендуется.
- Причинами ложноположительных результатов являются перекрестная реактивность с другими коронавирусами, образование антител из-за других механизмов или низкая точность теста.
Источник: Eugenia Yun. COVID Testing FAQ, From Reinfection to Persistent Positives. Medscape. June 10, 2020.
Обилие тестов на выявление COVID-19 и не всегда точные их результаты совсем запутали москвичей. Как разобраться в большом многообразии появляющихся вариантов диагностических систем? Что такое ПЦР или экспресс-тест? Какой из них является высокочувствительным, а какой — нет? Можно ли брать анализ у себя самого и отправлять в лабораторию? Расставить все по полочкам мы попросили заведующего лабораторией редактирования генома Национального медицинского исследовательского центра им. В.И.Кулакова, доктора биологических наук Дениса РЕБРИКОВА.
– Денис Владимирович, сориентируйте, пожалуйста, наших читателей в многообразии имеющихся диагностических тестов.
– Самый распространенный тест — на выявление генома вируса. У некоторых вирусов (ВИЧ, грипп, коронавирус) геном представлен не молекулой ДНК, а рибонуклеиновой кислотой — РНК. Но суть теста от этого не меняется, это обычная ДНК-диагностика. В подавляющем большинстве случаев она основана на методе ПЦР — полимеразной цепной реакции. Это самый надежный метод ДНК-диагностики, золотой стандарт определения вирусных инфекций. В среднем исследование занимает 3-4 часа. Но поскольку надо доставить образец в лабораторию, зарегистрировать его и пр., то времени уходит чуть больше. Как правило лаборатории заявляют, что выполнят тест от 8 часов до 2-3 дней. Если некоторые лаборатории заявляют, что «Результат будет сегодня», а другие обещают это только через 3 дня, это связано не с продолжительностью собственно анализа, а с логистикой обработки биоматериала.
– Кто сегодня производит эти тесты?
– На начало апреля в России уже семь производителей тест-систем для ДНК-диагностики имеют регистрационное удостоверение Росздравнадзора (документ, разрешающий применение теста в клинической лабораторной диагностике). Более-менее все они одинаковы по своей чувствительности и специфичности. Хотя самые первые тесты, рекомендованные к применению в феврале, отличались немного пониженной чувствительностью.
– То есть, в том случае, когда один аналог давал положительный результат, указывая на болезнь, другой мог дать отрицательный?
– Да, разные тест-системы могут давать разный ответ из-за разной заявленной производителем чувствительности реагентов. Кроме того, есть и фактор «врача»: в одном случае у пациента могли взять побольше вируса и его система «увидела», в другом — в пробирку попало меньше вирусных частиц, и ответ был ложно-отрицательным.
– Когда нам говорят: подготовлено столько-то единиц тест-систем, что имеется в виду?
– Один тест — это сочетание реагентов, рассчитанное на проведение анализа одного образца биоматериала (одного пациента). Он включает несколько этапов. Первый этап -высвобождение нуклеиновой кислоты из вируса (занимает минут 30-40), потом идет этап обратной транскрипции — превращение РНК в ДНК и ПЦР-амплификации (1,5 часа).
Каждый набор реагентов, как правило, поставляется в комплекте для анализа 96-ти образцов. Поэтому цифры поставленных тест-систем иногда плавают: кто-то считает комплектами, кто-то единицами тестов. Более корректно считать в единицах.
– Еще совсем недавно вроде бы ощущалась нехватка таких ПЦР-тестов. А сегодня нам сообщают, что Россия поставляет тест-системы в 30 стран мира. У нас действительно хватает тестов на всю страну?
– Семь производителей хорошо справляются с производством. У нас исторически хорошие мощности по производству такого рода реагентов.
– Почему тогда люди порой подолгу ждут результатов? Моя коллега, у которой подозревали инфицирование SARS-CoV-2, ждала результаты анализа больше недели.
– Дело в том, что ещё недели две назад результаты требовалось подтверждать в Новосибирском центре «Вектор». Если в Москве мы обнаруживали положительный образец, должны были контрольную копию доставить в Новосибирск. Пока анализы доставлялись туда, потом обратно, проходило как раз несколько суток. На сегодня отправка второго образца анализа из клиники идет для повторного подтверждения не в Новосибирск, а в московский региональный центр. На это уходит 1,5-2 дня.
– Такая же система действует и в других областях России?
— Да.
– Когда берут мазок, пациенту сообщают, что за тест, кто его производитель?
— Если это не коммерческое исследование, то скорей, нет. Но смею вас заверить, сегодня все тесты уже относятся к разряду высокочувствительных.
– И все-таки, если человек сдал биоматериал на первый анализ, а он дал отрицательный результат, когда ему назначат повторное взятие пробы?
– Через три дня, когда в биологическом образце частиц вируса будет больше. В течение этих трех дней человек должен быть изолирован. Если оба раза тест будет выдавать отрицательный результат, то в этом случае диагноз COVID-19 не ставится.
– Повторный анализ также производят в двух лабораториях?
– Да, по правилам требуется независимое подтверждение в референсной лаборатории.
— А насколько вероятен вариант с ложно-положительным результатом? После него не назначают повторный анализ?
– Вероятность ложно-положительного ответа при двух повторных тестах в разных лабораториях – менее 0,01%, то есть фактически отсутствует.
– В среду Роспотребнадзор объявил о том, что ряд лабораторий начинают в Москве массовый скрининг всех желающих с помощью платной высокочувствительной тест-системы. То есть, любой житель города может заказать диагностику и ему на дом привезут все необходимое.
– Насколько я понимаю, речь идет о том же, что коммерческие лаборатории практиковали и раньше, — оказывали подобные услуги со сбором биопробы на дому.
– Предлагают даже опцию, которая позволила бы пациенту брать у себя биопробы и отправлять в лабораторию…
– Самодеятельность в этом случае может дать некорректный результат. Брать мазок из горла должен врач или обученный лаборант. Если пациент сам не туда попадет, у него может быть ложно-отрицательный ответ.
– Почему мазок берется из носа и из горла?
– Такой на данный момент алгоритм взятия биоматериала, хотя, по сути, более правильным является мазок из горла.
– По крови можно определить болезнь?
– Для способа ПЦР можно использовать как мазок, так и кровь.
– Сейчас все чаще рекламируют некий экспресс-тест для выявления вирусных частиц в виде тест-полосок. Это альтернатива ПЦР?
– Скорей всего, когда речь идет о тест-полосках, имеется в виду ИФА — иммуно-ферментный анализ. Анализ вирусных частиц можно произвести при помощи ИФА, но вряд ли его сегодня будут использовать. Дело в том, что по точности и чувствительности он сильно уступает вышеописанному способу ПЦР. Зато появляются уже подобные тест-полоски для ИФА-теста на наличие антител в крови человека, уже переболевшего COVID-19. Вот они очень эффективны и дают результат через несколько минут.
Поэтому будьте внимательны и при заказе экспресс-тестов внимательно изучайте их предназначение. Кстати, некоторые производители тест-систем для ПЦР-диагностики могут и ее называть экспресс-тестом, в принципе, 3-4 часа, в течение которых она выполняется, это небольшой срок.
Читайте также: «У бессимптомно болевших коронавирусом обнаружились поражения легких»
МОСКВА, 6 дек — РИА Новости, Татьяна Пичугина. Недавняя публикация ученых из Сеченовского университета о том, что почти половина анализов на возбудителя COVID-19 не дают реальной картины, вызвала множество вопросов. Насколько точны ПЦР-тесты и нужны ли они для диагноза? РИА Новости разбирается в ПЦР-диагностике и почему в нее закрадываются ошибки.
Как выявляют вирус в организме
«Тяжело заболел наш сотрудник. Поднялась высокая температура, положили в больницу. Все признаки COVID-19, — рассказывает Алексей Чемерис, доктор биологических наук, профессор, сотрудник Института биохимии и генетики Уфимского ФИЦ РАН. — А ПЦР-анализ, который ему сделали в специальном медицинском центре наши коллеги-профессионалы, как только он почувствовал недомогание, — отрицательный. Видимо, в тот момент у больного было мало вирусных частиц в организме — за пределами чувствительности теста».
Ученые называют такие результаты ложнонегативными — инфекция проявляется внешне, а тест на возбудителя — «чистый». Тут дело и в самом методе, и в его массовом применении.
Когда медсестра берет мазок из ротоглотки и носоглотки, на кончике зонда остается немного влаги, а в ней — клетки эпителия. Зонд опускают в пластиковую пробирку с раствором (эппендорф) и кончик отламывают, чтобы закрыть емкость. В лаборатории ее помещают в центрифугу, проводят ряд манипуляций для выделения из клеток фрагментов вирусного генома. В случае с COVID-19 — это РНК коронавируса SARS-CoV-2.
В образовавшийся раствор добавляют праймеры — искусственные участки генома коронавируса, именно они опознают SARS-CoV-2, и один из них служит затравкой для синтеза цепочки ДНК под действием определенного фермента на основе механизма обратной транскрипции. Фактически получается ДНК-копия участка коронавируса, которую уже можно размножать. Для этого запускают ПЦР — полимеразную цепную реакцию. За несколько десятков циклов она увеличивает число копий ДНК, а специальный флуоресцентный краситель подсвечивает их в пробирке, сигнализируя о вирусе. Если в биоматериале нет вирусных частиц, ампликонов (продуктов ПЦР) не будет вовсе, результат — отрицательный. Если вируса очень мало, итоговое количество ампликонов по завершении ПЦР окажется за пределами чувствительности прибора и результат — ложноотрицательным.
Тонкости метода
В ПЦР-диагностике много нюансов, объясняет Алексей Чемерис. В лаборатории для научных целей выявляют даже единичные копии вирусного генома в образце, при массовом применении чувствительность обычно на порядки ниже.
«Из-за случайных мутаций генома праймеры могут не сработать, если однонуклеотидные замены или даже более значительные изменения генома вируса пришлись как раз на эти участки. Вероятность невысока, но она есть», — отмечает ученый.
Возможны сбои при ручных операциях, которых не так много. Одна из них — извлечение вирусной РНК из образца. Автоматический экстрактор нуклеиновых кислот стоит довольно дорого, поэтому обычно эту процедуру доверяют лаборанту. Редко, но ложноположительные результаты случаются, в том числе из-за особенностей ПЦР или загрязнения образца.
Чаще всего, однако, проблемы возникают до того, как пробирка попала в лабораторию. Вот что пишут авторы статьи в журнале «Вестник Росздравнадзора»: «В настоящее время имеются неопровержимые доказательства того, что преаналитическая фаза является основным источником ошибок в лабораторных исследованиях, когда они используются для диагностических или исследовательских целей». Они публикуют целый список нарушений, ведущих к ложноотрицательным результатам.
Ключевой этап — подготовка к исследованию. «За три часа до анализа нельзя есть, пить, курить и полоскать рот. Дело в том, что коронавирус поражает клетки слизистой оболочки дыхательных путей. Проникая в них, он начинает размножаться, накапливается на их поверхности. Но есть еще и эпителиальные клетки, которые часто обновляются. Вместе с водой, едой и избытком слюны при курении и жевании жвачки эпителиальные клетки попадают в пищевод. В результате вероятность обнаружить вирус в мазке падает практически до нуля», — комментирует Тамара Силкина, врач клинической лабораторной диагностики, директор по лабораторным технологиям «Гемотеста».
Не менее важна процедура взятия биоматериала. Если неверно выбрать точку для мазка, например, из-за кашля или рвотного рефлекса, на зонд может не попасть достаточное количество клеток. На результат также влияют нарушения технологии хранения, транспортировки образцов.
«Цена ошибки очень высока — процент выявляемости коронавирусной инфекции снизится, а скорость ее распространения вырастет. Люди, получившие ложноотрицательные результаты, будут чувствовать себя спокойно, выходить в общественные места и контактировать с окружающими», — уточняет представитель «Гемотеста».
Ключевой этап — подготовка к исследованию. «За три часа до анализа нельзя есть, пить, курить и полоскать рот. Дело в том, что коронавирус поражает клетки слизистой оболочки дыхательных путей. Проникая в них, он начинает размножаться, накапливается на их поверхности. Но есть еще и эпителиальные клетки, которые часто обновляются. Вместе с водой, едой и избытком слюны при курении и жевании жвачки эпителиальные клетки попадают в пищевод. В результате вероятность обнаружить вирус в мазке падает практически до нуля», — комментирует Тамара Силкина, врач клинической лабораторной диагностики, директор по лабораторным технологиям «Гемотеста».
Не менее важна процедура взятия биоматериала. Если неверно выбрать точку для мазка, например, из-за кашля или рвотного рефлекса, на зонд может не попасть достаточное количество клеток. На результат также влияют нарушения технологии хранения, транспортировки образцов.
«Цена ошибки очень высока — процент выявляемости коронавирусной инфекции снизится, а скорость ее распространения вырастет. Люди, получившие ложноотрицательные результаты, будут чувствовать себя спокойно, выходить в общественные места и контактировать с окружающими», — уточняет представитель «Гемотеста».
О точности диагностики
В России одобрены к использованию десятки тест-систем для выявления коронавируса. Ключевые характеристики — диагностические специфичность (точность) и чувствительность. Первый параметр показывает способность набора определить конкретный вирус. Второй — возможность обнаружить его части, даже если в биоматериале их очень мало. «Чем эти параметры ближе к ста процентам, тем лучше», — подчеркивает Тамара Силкина.
«Порог чувствительности — общий как для российских, так и для зарубежных тестов: 10³ на миллилитр. То есть должно быть не менее тысячи вирусных геном-эквивалентов на миллилитр образца. «ДНК-технология» заявила о чувствительности 10¹ — десять вирусных единиц на миллилитр. Другой важный показатель — воспроизводимость, то есть возможность получить одинаковый результат в разных условиях. Нужно учитывать и сходимость — отсутствие существенных различий между измерениями, выполненными в одинаковых условиях», — добавляет медик.
Метод ПЦР с обратной транскрипцией хорошо отработан и практически полностью автоматизирован. С момента попадания в лабораторию анализ занимает четыре-шесть часов. В мире эти тесты буквально поставили на поток. Только в Москве, по официальным данным, сделали 12 миллионов анализов.
Поскольку этот метод прямо выявляет возбудителя в организме, его относят к доказательной медицине и рекомендуют учитывать в клинической практике. Однако анализ больших данных говорит, что при массовом использовании ПЦР-тесты часто промахиваются.
Ложнонегативные результаты получаются в 20-66 процентах случаев. Такие данные из литературы приводят исследователи из Сеченовского университета. Вместе с зарубежными коллегами они изучили записи пациентов, госпитализированных в университетскую клинику в апреле — мае. Из 3480 человек, чьи ПЦР-тесты были доступны, примерно половина оказались чистыми. В то же время клиническая картина и КТ легких указывали на коронавирусную инфекцию. Авторы допускают, что в реальной клинической практике ПЦР-анализ не столь и критичен.
«Этиологическая диагностика, которая выявляет причину заболевания, нужна априори, — не соглашается Айрат Мавзютов, заведующий кафедрой фундаментальной и прикладной микробиологии, профессор кафедры лабораторной диагностики Башкирского государственного медицинского университета, руководитель Исследовательского центра «Лаборатория». — При вирусных инфекциях других, сравнимых по чувствительности и специфичности (точности), методов, кроме ПЦР-тестирования, нет».
Важно понимать, объясняет профессор Мавзютов, что клинический диагноз опирается на субъективные данные — анамнез (опрос) и осмотр пациента. На их основании невозможно установить вирусную природу заболевания и тем более какой именно возбудитель его вызвал. Для этого проводятся лабораторные исследования. Получаемые при этом данные, продолжает ученый, намного объективнее, поскольку большинство современных методов лабораторных исследований автоматизировано. Соответственно, на результаты не повлияют случайные факторы: уровень подготовки специалистов, их настроение, «погода в доме» и так далее.
«Диагноз COVID-19 можно поставить, только когда в материале от больного обнаружили РНК вируса SARS CoV-2 методом ПЦР или же антигены этого вируса иммунохимическими методами. Не выявив следов вируса в организме, нельзя говорить о «ковидной» природе заболевания или летального исхода», — утверждает Айрат Мавзютов.
Он обращает внимание на еще один аспект. ПЦР-тест не отличает РНК вируса, способного к репродукции, то есть размножению, от обломков «нежизнеспособных» вирусных частиц. Он лишь позволяет понять, присутствует или нет РНК коронавируса в клетках.
«Пока инфицированные клетки не заменятся на новые, а на это уходит от двух до четырех недель, не исключены положительные результаты. При этом вирус может быть уже «мертвым», человек здоров и никому не опасен», — отмечает профессор. Для уточнения учитываются данные целого ряда дополнительных исследований, позволяющих на лабораторном уровне оценивать остроту воспалительного процесса или образование антител на стадии его завершения.
Альтернатива ПЦР-диагностике
В любом случае нужно повышать чувствительность тест-систем на основе ПЦР, заключает Алексей Чемерис, а для этого нужны другие подходы. «Надо сделать так, чтобы ложнонегативных результатов было меньше, практически исключить их», — считает он.
В обзоре, подготовленном вместе с коллегами, профессор Чемерис рассматривает преимущества и недостатки ПЦР-диагностики и других методов амплификации — копировании РНК бетакоронавирусов, к которым относится SARS-CoV-2. Теоретически весьма перспективен метод петлевой амплификации — LAMP, где используют сразу шесть или восемь праймеров.
«С одной стороны, повышается специфичность: только когда все праймеры отожгутся (сработают, распознав РНК коронавируса. — Прим. ред.), начнется амплификация, с другой — вирус мутирует и шансы, что реакция не пойдет, увеличиваются, поскольку какие бы участки генома ни выбрать, все равно вероятность мутаций больше в восьми участках, чем в двух или трех (при использовании гибридизационного зонда), достаточных для ПЦР», — объясняет исследователь.
Во время предшествующей эпидемии SARS возбудителя выявляли с помощью реакции NASBA (амплификации на основе секвенирования нуклеиновых кислот) и RCA (репликации по типу катящегося кольца). Геномный редактор CRISPR-Cas также пробуют применять для идентификации РНК нового коронавируса. Есть работы по полногеномному секвенированию любого генетического материала, находящегося в биоматериале. Метод очень чувствительный, но дорогой и долгий — занимает 20 часов. Так что в ближайшее время ПЦР с обратной транскрипцией останется самым массовым способом обнаружения коронавируса в организме.