Некоторые ошибки при постановке ифа

Институт средств медицинской диагностики ЗАО «Вектор-Бест»

А.В. Масяго

НЕКОТОРЫЕ ОШИБКИ ПРИ ПОСТАНОВКЕ ИФА

Информационно-методическое пособие / Новосибирск — 2006.

Многолетний опыт работы ЗАО «Вектор-Бест» по производству иммуноферментных тест-систем, постоянный контакт с широким кругом потребителей продукции, как из хорошо оснащенных диагностических центров, так и из лабораторий, имеющих минимально необходимое для постановки иммуноферментного анализа (ИФА) оборудование, дает нам возможность классифицировать и вскрыть причины некоторых ошибок, допускаемых при проведении иммуноферментного анализа. Автор не претендует на полноту освещения проблемы, однако надеется, что эта брошюра может быть полезна для наших читателей, использующих в своей работе ИФА.

Сотрудники ЗАО «Вектор-Бест» будут благодарны всем за любые замечания, предложения и описания случаев из личной практики, которые обязательно будут учтены при подготовке нового, более полного издания.

Содержание

1. Помещение
2. Оборудование и расходные материалы
3. Подготовка образцов
4. Инструкция по применению
5. Действия во внештатной ситуации
6. Внешний и внутренний контроли
7. Сравнение с результатами других диагностических методов
Приложение
- Чувствительность и специфичность
- Как правильно сравнить две тест-системы?
- Типичные ошибки при сравнении тест-систем, оценке чувствительности и специфичности
- Прогнозируемые значения
- Примеры использования значений ППЗ и ОПЗ
- Предлагаемая методика подготовки одноразовых наконечников для пипеток к повторному использованию
Дезинфекция

Источник

Информационный бюлетень. Выпуск №3

Инфекционная безопасность гемотрансфузионной терапии
ВИЧ в России: проблемы и перспективы
Иммуноферментный анализ в диагностике гельминтозов
Ранняя диагностика беременности
Чувствительность и специфичность качественных методов диагностики
Некоторые ошибки при постановке ИФА. Глава 2. Оборудование и расходные материалы. (Продолжение. Начало в №1)
Вирус гепатита В. Главы из обзора. Глава 2. Диагностика вирусного гепатита В (ВГВ). (Продолжение. Начало в № 2)
К вопросу о диагностике гепатита С
Отзывы наших клиентов
Новое оборудование

Скачать выпуск

Источник

лиза, сокращается время его проведения, уменьшается расход реагентов. Идёт постоянный поиск всё новых и новых ферментов, используемых в качестве маркеров. Всё возрастающее влияние на ИФА оказывают химия высокомолекулярных соединений, клеточная и генная инженерия, под влиянием которых меняются технологии получения реагентов для ИФА. Так, если до внедрения ген- но-инженерных методов приходилось выделять антитела из биологических сред (а хорошая очистка требует существенных затрат и времени, и реагентов, и ресурса оборудования), то в настоящее время есть возможность использовать клетки насекомого (сверчка, цикады, таракана) или E. coli для производства требуемого рекомбинантного белка, который при сохранении требуемых биологических свойств вдобавок получается сравнительно чистым, так что его значительно проще выделить из смеси и сохранить в стабилизирующем растворе.

Методическая и нормативная литература

1.Данилова Л.А., Башарина О.Б., Красникова Е.Н., Литвиненко Л.А., Раменская Н.П., Фоменко М.О., Машек О.Н. Справочник по лабораторным методам исследования. Под ред.Даниловой Л.А., Москва; сер. Спутник врача. 2003.

2.А.М. Егоров, А.П. Осипов, Б.Б. Дзантиев, Е.М. Гаврилова. Теория и практика иммуноферментного анализа. — М.: Издательство «Высшая школа»,

1991. — С. 3–42.

3.Иммунохимический анализ в лабораторной медицине / В. В. Долгов. — М.-Тверь: ООО «Издательство «Триада»», 2015. — С. 34-38.

4.Некоторые ошибки при постановке ИФА. Институт средств медицинской диагностики. ЗАО «Вектор-Бест». А.В. Масяго. Информационно-методическое пособие. Кольцово 2004.

5.Иммуноферментный анализ в клинико-диагностических лабораториях. В.В. Долгов, Н.Г. Ракова, В.Е. Колупаев, Н.С. Рытикова.

6.Санитарные правила и нормы «Правила сбора, хранения и удаления отходов лечебно-профилактических учреждений» СанПиН 2.1.7.728-99, Минздрав России, 1999

7.Руководство «Использование ультрафиолетового бактерицидного излучения для обеззараживания воздуха в помещениях» Р 3.5.1904-04. М.: 2005

8.Приказ МЗ РФ №45 «О системе мер по повышению качества клинических лабораторных исследований в учреждениях здравоохранения Российской Федерации» от 07.02.2000

9.ГОСТ Р ИСО 15189–2009 Лаборатории медицинские. Частные требования к качеству и компетентности. – М.: Стандартинформ, 2010. – 38 с.

10.ГОСТ Р 53434–2009 Принципы надлежащей лабораторной практики. – М.: Стандартинформ, 2010. – 11 с.

11.ГОСТ Р 52905–2007 Лаборатории медицинские. Требования безопасности. – М.: Стандартинформ, 2010. – 36 с.

12.ГОСТ Р 53022.2–2008 Требования к качеству клинических лабораторных исследований. Часть 2. Оценка аналитической надежности методов исследования (точность, чувствительность, специфичность). – М.: Стандартинформ, 2009. – 28 с.

Коллектив авторов:

Шалепо Кира Валентиновна – к.б.н., доцент кафедры клинической лабораторной диагностики ФП и ДПО ФГБОУ ВО СПБГПМУ Минздрава России, старший научный сотрудник лаборатории микробиологии ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О.Отта»

Спасибова Елена Владимировна – ассистент кафедры клинической лабораторной диагностики ФП и ДПО ФГБОУ ВО СПБГПМУ Минздрава России, врач-бактериолог лаборатории микробиологии ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О.Отта»

Будиловская Ольга Викторовна – ассистент кафедры клинической лабораторной диагностики ФП и ДПО ФГБОУ ВО СПБГПМУ Минздрава России, научный сотрудник лаборатории микробиологии ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О.Отта»

Хуснутдинова Татьяна Алексеевна – ассистент кафедры клинической лабораторной диагностики ФП и ДПО ФГБОУ ВО СПБГПМУ Минздрава России, научный сотрудник лаборатории микробиологии ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О.Отта»

Крысанова Анна Александровна – ассистент кафедры клинической лабораторной диагностики ФП и ДПО ФГБОУ ВО СПБГПМУ Минздрава России, научный сотрудник лаборатории микробиологии ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О.Отта»

Шипицына Елена Васильевна – д.б.н., профессор кафедры клинической лабораторной диагностики ФП и ДПО ФГБОУ ВО СПБГПМУ Минздрава России, ведущий научный сотрудник лаборатории микробиологии ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О.Отта»

Воробьев Сергей Владимирович – д.м.н., профессор кафедры клинической лабораторной диагностики ФП и ДПО ФГБОУ ВО СПБГПМУ Минздрава России

Савичева Алевтина Михайловна – заслуженный деятель науки РФ, д.м.н., профессор, заведующая кафедрой клинической лабораторной диагностики ФП и ДПО ФГБОУ ВО СПБГПМУ Минздрава России, заведующая лабораторией микробиологии ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О.Отта»

Учебное издание

Шалепо Кира Валентиновна, Спасибова Елена Владимировна, Будиловская Ольга Викторовна, Хуснутдинова Татьяна Алексеевна, Крысанова Анна Александровна, Шипицына Елена Васильевна, Воробьев Сергей Владимирович, Савичева Алевтина Михайловна

Иммуноферментный анализ (ИФА) в клинической лабораторной диагностике. Общие принципы.

Учебно-методическое пособие

Подписано в печать 21.02.2018 г. Формат 60×84 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Таймс. Объем 1,5 печ. л. Тираж 100 экз. Заказ № 11.

Отпечатано в ЦМТ СПбГПМУ

ISBN 978-5-907065-00-0

Источник

Ошибочные результаты анализов на сифилис. Ложноположительные и ложноотрицательные результаты.

Ложноположительные (ЛПР) и ложноотрицательные серологические реакции на сифилис

Error

Инфекционная безопасность гемотрансфузионной терапии
ВИЧ в России: проблемы и перспективы
Иммуноферментный анализ в диагностике гельминтозов
Ранняя диагностика беременности
Чувствительность и специфичность качественных методов диагностики
Некоторые ошибки при постановке ИФА. Глава 2. Оборудование и расходные материалы. (Продолжение. Начало в №1)
Вирус гепатита В. Главы из обзора. Глава 2. Диагностика вирусного гепатита В (ВГВ). (Продолжение. Начало в № 2)
К вопросу о диагностике гепатита С
Отзывы наших клиентов
Новое оборудование

Скачать выпуск

Источник

Методическая и нормативная литература

1991. — С. 3–42.

10.ГОСТ Р 53434–2009 Принципы надлежащей лабораторной практики. – М.: Стандартинформ, 2010. – 11 с.

11.ГОСТ Р 52905–2007 Лаборатории медицинские. Требования безопасности. – М.: Стандартинформ, 2010. – 36 с.

Коллектив авторов:

Учебное издание

Иммуноферментный анализ (ИФА) в клинической лабораторной диагностике. Общие принципы.

Учебно-методическое пособие

Отпечатано в ЦМТ СПбГПМУ

ISBN 978-5-907065-00-0

Источник

Ошибочные результаты анализов на сифилис. Ложноположительные и ложноотрицательные результаты.

Ложноположительные (ЛПР) и ложноотрицательные серологические реакции на сифилис

Error

Ложноположительные серологические реакции на сифилис (ЛПР) – это положительные реакции у людей, которые никогда не болели и в момент обследования не болеют сифилисом. То есть специфической инфекции в организме нет и не было, а серологические реакции дают положительный результат.

Ложноположительными, или неспецифическими результатами называют положительные результаты серологических реакций на сифилис у лиц, не страдающих сифилитической инфекцией, и не болевших сифилисом в прошлом.

Ошибочный анализ на сифилис из-за технических причин

ЛПР могут быть обусловлены техническими погрешностями и ошибками при выполнении исследований, а также качеством реагентов. Несмотря на многочисленные достоинства диагностикумов для РПГА, ИФА и РИФ и их модификаций, применяемых для диагностики сифилиса, в отдельных случаях отмечаются недостоверные результаты анализов. Это может быть связано как с недостаточным уровнем квалификации и профессиональной ответственности персонала (так называемые небиологические или технические ошибки), так и с особенностями тестируемых образцов (биологические ошибки).

Ошибки небиологического характера могут возникать на любом этапе проведения исследований: преданалитическом, аналитическом, и постаналитическом т.е. при заборе, транспортировке, хранении биоматериала, использовании хилезной, проросшей сыворотки, при неоднократном замораживании и оттаивании тестируемых образцов, а также при использование диагностикумов с истекшим сроком годности и т.д. В частности, несоблюдение условий и сроков хранения диагностических наборов является причиной снижения чувствительности реакции и получения ложноотрицательных результатов.

Ложноположительные результаты может вызвать контаминация сывороток пациентов, серонегативных в отношении бледной трепонемы, следами сывороток серопозитивных лиц, что может иметь место при приготовлении сывороток.

Существует множество других технических ошибок, приводящих к получению недостоверных (ложноотрицательных и ложноположительных), сомнительных результатов исследования. В некоторых лабораториях не осуществляется внутри- и внешнелабораторный контроль качества исследований на сифилис, что ведет к получению диагностических ошибок и неуверенности врачей-лаборантов в результатах анализа.

Источником ошибок при постановке неспецифических тестов могут быть неиспользование контрольных сывороток, неравномерная концентрация антигена в опыте из-за недостаточного перемешивания ее перед использованием, контаминация образцов и посуды микроорганизмами, нарушение сроков и условий хранения компонентов реакции, нарушение техники взятия крови.

В современных тест-системах в качестве антигена нашли применение рекомбинантные или синтетические пептиды. Первые получили большее распространение. Но при плохой очистке в смесь антигенов T. pallidum попадают белки Escherichia coli, что приводит к ложной серодиагностике сифилиса у больных эшерихиозом или здоровых, в сыворотке которых обнаружены антитела к кишечной палочке.

В определенной степени к диагностическим ошибкам следует отнести и неправильную трактовку результатов исследования.

Острые и хронические ЛПР

Помимо технических ошибок при выполнении тестов, ЛПР могут быть обусловлены и особенностями организма. Условно ЛПР разделяют на острые (менее 6 месяцев) и хронические (сохраняются более 6 месяцев).

Острые ЛПР могут наблюдаться при беременности и во время менструации, после вакцинации, после недавно перенесенного инфаркта миокарда, при многих инфекционных заболеваниях. Инфекции, при которых могут отмечаться ЛПР — пневмококковая пневмония, скарлатина, инфекционный эндокардит, туберкулез, лепра, венерическая лимфогранулема, шанкроид (мягкий шанкр), лептоспироз и другие спирохетозы, ВИЧ-инфекция, инфекционный мононуклеоз, малярия, ветряная оспа, вирусные гепатиты, паротит, корь, респираторные заболевания, грипп и дерматозы.

Острые ЛПР нестойки, их спонтанная негативация происходит в течение 4-6 месяцев.

Хронические ЛПР возможны при аутоиммунных заболеваниях, системных болезнях соединительной ткани, онкологических заболеваниях, хронической патологии печени и желчевыводящих путей, при сердечно-сосудистой и эндокринной патологии, при заболеваниях крови, при хронических заболеваниях легких, при инъекционном применении наркотиков и др. При большинстве этих состояний выявляют антикардиолипиновые антитела классов IgG и IgM («реагины»).

Хронические ложноположительные реакции могут оставаться позитивными в течение всей жизни.

Хронические ложноположительные реакции могут являться преклиническими проявлениями тяжелых заболеваний. При злокачественных новообразованиях, диффузных болезнях соединительной ткани титр ЛПР может быть очень высоким.

Среди причин хронических положительных реакций выделяют физиологические состояния (пожилой возраст). С возрастом количество ЛПР увеличивается, у женщин они наблюдаются в 4,5 раза чаще, чем у мужчин. В возрастной группе 80-летних лиц распространенность ЛПР составляет 10%.

Причиной ЛПР могут быть частое использование вводимых внутривенно препаратов, частые переливания и инфузии.

Хронические инфекции (туберкулез, лепра, инфекционный эндокардит, малярия), миелома также могут стать причинами ЛПР.

Заражение другими видами спирохет

Ложноположительные реакции трепонемных и нетрепонемных тестов могут наблюдаться при инфекционных заболеваниях, возбудители которых имеют антигенное сходство с бледной трепонемой. Это возвратный тиф, лептоспироз, клещевой боррелиоз, тропические трепонематозы (фрамбезия, беджель, пинта), а также воспалительные процессы, обусловленные сапрофитными трепонемами полости рта и гениталий.

Возбудители эндемических трепонематозов (фрамбезия, пинта, беджель) — это трепонемы, которые обладают родоспецифическими антигенами, сходными с антигенами T.pallidum. В связи с этим антитела, образующиеся к ним, способны вступать в перекрестные взаимодействия с антигеном возбудителя сифилиса.

Россия не является территорией, эндемичной по данной группе заболеваний. Эти инфекции встречаются главным образом, в странах Африки, Латинской Америки и Южной Азии, и случаи заболеваний редки в практике лечебных учреждений.

Пациента с положительными серологическими реакциями на сифилис, прибывшего из страны с эндемическими трепонематозами, необходимо обследовать на сифилис и назначить противосифилитическое лечение, если оно ранее не проводилось.

Биологическая ложноположительная реакция Вассермана

Начиная с 1938 года, и особенно во время Второй Мировой войны, в США стали широко проводиться скрининговые серологические исследования для выявления сифилиса. Исследователи сопоставили полученные данные и выяснили, что положительная или сомнительная реакция обнаруживалась у людей не имевших клинических и эпидемиологических признаков сифилитической инфекции или контактов по сифилису. Причем такие результаты возникали гораздо чаще, чем предполагалось ранее. Положительные результаты нетрепонемных тестов с липидными или кардиолипиновыми антигенами (VDRL, в тестах Колмера, реакции Кана) были обнаружены у пациентов с различными заболеваниями, но не имеющих признаков сифилитической инфекции. Биологические ложнополжительные результаты были выявлены у пациентов с аутоиммунными, воспалительными и гематологическими заболеваниями.

В русскоязычной медицинской литературе этот феномен получил наименование «биологическая ложноположительная реакция Вассермана» (Б-ЛПРВ), т.к. указанные результаты наблюдались при проведении самого распространенного теста тех времен — реакции Вассермана.

Оказалось, что Б-ЛПРВ может встречаться в двух основных вариантах — остром и хроническом. В первом случае у больных, перенесших какую-либо, но не сифилитическую инфекцию, Б-ЛПРВ исчезает в процессе выздоровления, и длительность ее обнаружения не превышает шести месяцев. Во втором случае Б-ЛПРВ может устойчиво сохраняться в течение многих лет в отсутствие очевидного причинного фактора. В начале 50-х годов было установлено, что наиболее часто хроническая Б-ЛПРВ выявляется при аутоиммунных заболеваниях, особенно СКВ, при которой частота ее обнаружения достигает 30—44%

Ложноположительность нетрепонемных (кардиолипиновых) тестов

Липидные антигены T. pallidum cоставляют значительную часть клетки, однако в организме могут присутствовать и имеющие такое же строение липиды – аутоантигены, образующиеся в результате разрушения органов и тканей (в основном липиды митохондриальных мембран).

Сифилитическая инфекция сопровождается образованием иммунных комплексов и аутоиммунным ответом на кардиолипин, фибронектин, коллаген и мышечную креатинкиназу. В нетрепонемных тестах в качестве антигена используют раствор трех высокоочищенных липидов (кардиолипин, стабилизированный лецитином и холестерином) в этиловом спирте. Кардиолипин не является специфичным компонентом для T. pallidum, а также описан как один из фосфолипидов биомембран человека. Поэтому антитела к этому антигену регистрируют в сыворотке практически при любой альтерации клеток человека в результате инфекций и при некоторых физиологических и патологических состояниях.

Так как антиген, используемый в нетрепонемных реакциях, обнаруживается в других тканях, тесты могут давать положительные результаты у лиц без трепонемной инфекции (1—2 % в общей популяции).

Наиболее частой причиной биологических ложноположительных нетрепонемных тестов является антифосфолипидный синдром — аутоиммунный процесс, встречающийся при заболеваниях соединительной ткани (системной красной волчанке, дерматомиозите, склеродермии).

При использовании нетрепонемных тестов (РМП и ее модификаций) ложноположительные результаты могут быть обусловлены наличием в крови антител к ревматоидному фактору, перекрестно реагирующих антител при аутоиммунной патологии («кресс-реактеры»).

Другими факторами возникновения ложноположительных результатов считаются некоторые хронические бактериальные инфекции (лепра и др.), заболевания вирусной этиологии (инфекционный мононуклеоз), системные болезни соединительной ткани.

Причины также могут заключаться в пожилом возрасте (старше 70 лет), беременности, обширной соматической патологии, нарушениях обмена липидов, иммунодефицитных состояниях различной этиологии, системными хроническими заболеваниями сердца, легких.

Среди других причин следует отметить онкологические заболевания, туберкулез, энтеровирусные инфекции, вирусные гепатиты, болезнь Лайма, пневмонии, алкоголизм, наркоманию, сахарный диабет, вакцинацию, другие инфекции (малярия, ветряная оспа, корь, эндо- и миокардиты), подагру.

При этих состояниях отмечается развитие иммунологических нарушений, приводящих к аномальной продукции антител, способных перекрестно реагировать и с трепонемными антигенами.

Таблица. Биологические причины ложноположительных реакций при нетрепонемных серологических тестах.

Острые (<6 месяцев)	Хронические (>6 месяцев)
Физиологические состояния: Беременность Вакцинация некоторыми видами вакцин	Физиологические состояния: Пожилой возраст
Бактериальные инфекции: Пневмококковая пневмония Скарлатина Инфекционный эндокардит	Бактериальные и другие инфекции: Инфекционный эндокардит Малярия
Микобактериальные инфекции: Туберкулез Лепра	Микобактериальные инфекции: Туберкулез Лепра
Другие ИППП: Шанкроид (мягкий шанкр) Венерическая лимфогранулема	Заболевания соединительной ткани: Системная красная волчанка
Инфекции, вызываемые другими спирохетами: Возвратный тиф Лептоспироз Лайм-бореллиоз	Онкологические заболевания: Миелома Лимфома
Вирусные инфекции: ВИЧ Инфекционный мононуклеоз Корь Ветряная оспа Паротит (свинка) Вирусный гепатит	Другие причины: Инъекционная наркомания Множественные переливания крови Сахарный диабет

Ложноположительность трепонемных тестов

Проблема усугубляется тем, что трепонемные тесты также могут быть ложноположительными. Причинами могут являться аутоиммунные заболевания, коллагенозы, болезнь Лайма, беременность, лепра, герпес, малярия, инфекционный мононуклеоз, опухоли, наркомания. В последние годы для дифференциации ЛПР за рубежом начали активно использовать иммуноблоттинг — один из самых современных методов диагностики сифилиса.

Сохранение антител после успешного лечения

Специфические диагностические реакции длительное время остаются положительными даже после полноценной терапии. После эффективного лечения сифилитической инфекции, у большинства больных титры в нетрепонемных тестах снижаются в 4 раза через 6–12 месяцев после лечения. Однако, при позднем начале терапии, титры даже в нетрепонемных тестах могут сохраняться на прежнем уровне, но никогда не увеличиваться.

Ложноотрицательные результаты анализов

Различные методы диагностики демонстрируют различную чувствительность и специфичность в зависимости от формы и стадии сифилиса. Вероятность ошибочного диагноза возрастает, особенно в случаях латентного, скрытого, сочетанного течения заболевания.

Ложноотрицательные серологические реакции на сифилис могут наблюдаться при вторичном сифилисе вследствие феномена прозоны при тестировании неразведенной сыворотки, а также при обследовании лиц с иммунодефицитным состоянием, например ВИЧ-инфицированных пациентов.

Ложноотрицательные результаты серологических специфичес- ких реакций (РПГА), вызванные биологическими факторами, могут быть обусловлены конкуренцией между специфическими IgM и IgG за связывание с антигеном на поверхности эритроцитов, а также «феноменом прозоны». В последнем случае агглютинация не происходит из-за гиперпродукции антител к бледной трепонеме, поскольку каждый антиген-рецептор на эритроцитах из-за избытка антител связан с одной молекулой агглютинина, что препятствует образованию «решетки». Замена РПГА на TPPA, т.е. эритроцитов на синтетические частицы, видимо, исключит или минимизирует получении ложноотрицательных результатов.

В ИФА такие реакции можно объяснить наличием серонегативной фазы при первичном сифилисе, а при вторичном — иммунной недостаточностью, наличием ВИЧ-инфекции. При получении отрицательного результата серологических исследований на сифилис следует учитывать свойство бледных трепонем проникать и размножаться в различных органах и тканях — поиск возбудителя в лимфе (лимфатических узлах) в ряде случаев приводит к достоверному результату. Целесообразно повторить также анализ образцов, давших положительный результат. Повторное, через 5–7 и более дней, исследование сывороток, как правило, позволяет получить достоверные результаты.

Источник

Ошибочные результаты анализов на сифилис. Ложноположительные и ложноотрицательные результаты.

Ложноположительные (ЛПР) и ложноотрицательные серологические реакции на сифилис

Ошибочные результаты анализов на сифилис. Ложноположительные и ложноотрицательные результаты.

Ложноположительные (ЛПР) и ложноотрицательные серологические реакции на сифилис

Ошибочный анализ на сифилис из-за технических причин

Острые и хронические ЛПР

Заражение другими видами спирохет

Ложноположительность нетрепонемных (кардиолипиновых) тестов

Ложноположительность трепонемных тестов

Сохранение антител после успешного лечения

Ложноотрицательные результаты анализов

Возможно, вам также будет интересно: