Молекулярные маркеры причины и последствия ошибок генотипирования

Ganal M.W., Polley A., Graner E.M., Plieske J., Wieseke R., Luerssen H., Durstewitz G. Large SNP arrays for genotyping in crop plants // J Biosci. – 2012. – Vol. 37. – P. 821-288.

Miedaner T., Korzun V. Marker-assisted selection for disease resistance in wheat and barley breeding // Phytopathology. – 2012. – Vol.102. – P. 560-566.

Paux E., Sourdille P., Mackay I., Feuillet C. Sequence-based marker development in wheat: advances and applications to breeding // Biotechnol Adv. – 2001. – Vol. 30. – P. 1071-1088.

Hall D., Tegström C., Ingvarsson P.K. Using association mapping to dissect the genetic basis of complex traits in plants // Brief Funct Genomics. – 2010. – Vol. 9. – P. 157-165.

Zimmer E.A., Wen J. Using nuclear gene data for plant phylogenetics: progress and prospects // Mol Phylogenet Evol. – 2012. – Vol. 65. – P. 774-785.

Kumar P., Gupta V.K., Misra A.K., Modi D. R., Pandey B. K. Potential of Molecular Markers in Plant Biotechnology // Plant Omics Journal. – 2009. – Vol. 2. – Р. 141-162.

Woodhead M., Russell J., Squirrell J., Hollingsworth P. M., Mackenzie K., Gibb M., Powell W. Comparative analysis of population genetic structure in Athyrium distentifolium (Pteridophyta) using AFLPs and SSRs from anonymous and transcribed gene regions // Molecular Ecology. – 2005. – Vol. 14. – Р. 1681-1695.

Kuczmog A., Galambos A., Horváth S., Mátai A., Kozma P., Szegedi E., Putnoky P. Mapping of crown gall resistance locus Rcg1 in grapevine // Theor Appl Genet. – 2012. – Vol.125. – P. 1565-1574.

Ujihara T, Taniguchi F, Tanaka J, Hayashi N. Development of Expressed Sequence Tag (EST)-based Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (CAPS) markers of tea plant and their application to cultivar identification // J Agric Food Chem. – 2011. – Vol. 59. – P. 1557-1564.

Segatto A.L.A., Caze A.L.R., Turchetto C., Klahre U., Kuhlemeier C., Bonatto S.L., Freitas L.B. Nuclear and plastid markers reveal the persistence of genetic identity: A newperspective on the evolutionary history of Petunia exserta // Molecular Phylogenetics and Evolution. — 2014. – Vol.70. – P. 504–512.

Cui Y., Lee M.Y., Huo N., Bragg J., Yan L., Yuan C., Li C., Holditch S.J., Xie J., Luo M.C., Li D., Yu J., Martin J., Schackwitz W., Gu Y.Q., Vogel J.P., Jackson A.O., Liu Z., Garvin D.F. Fine mapping of the Bsr1 barley stripe mosaic virus resistance gene in the model grass Brachypodium distachyon // PLoS One. – 2012. – Vol. 7:e38333.

Jo K.-R., Arens M., Kim T.-Y., Jongsma M.A., Visser R.G.F., Jacobsen E., Vossen H.J. Mapping of the S. demissum late blight resistance gene R8 to a new locus on chromosome IX // Theor Appl Genet. – 2011. – Vol. 123. – P. 1331–1340.

Shu Q.Y., Liu G.S., Qi D.M., Chu C.C., Liu .J, Li H.J. An effective method for axillary bud culture and RAPD analysis of cloned plants in tetraploid black locust // Plant Cell Rep. – 2003. – Vol. 22. – P. 1751-1780.

Sreedhar R.V., Venkatachalam L., Bhagyalakshmi N. Genetic fidelity of long-term micropropagated shoot cultures of vanilla (Vanilla planifolia Andrews) as assessed by molecular markers // Biotechnol. J. – 2007. – Vol. 2. – P. 1007–1013.

Rai G.K, Singh M., Rai N.P., Bhardwaj D.R., Kumar S. In vitro propagation of spine gourd (Momordica dioica Roxb.) and assessment of genetic fidelity of micropropagated plants using RAPD analysis // Physiol Mol Biol Plants. – 2012. – Vol. 18. – P. 273-280.

Kim J.K., An G.H., Ahn S.H., Moon Y.H., Cha Y.L., Bark S.T., Choi Y.H., Suh S.J., Seo S.G., Kim S.H., Koo B.C. Development of SCAR marker for simultaneous identification of Miscanthus sacchariflorus, M. sinensis and M. x giganteus // Bioprocess Biosyst Eng. – 2012. – Vol.35. – P. 55-59.

Pankin A.A., Khavkin E.E. Genome-specific SCAR markers help solve taxonomy issues: a case study with Sinapis arvensis (Brassiceae, Brassicaceae) // Am J Bot. – 2011. – Vol. 98:e54-7.

Ray T., Roy S.C. Genetic diversity of Amaranthus species from the Indo-Gangetic plains revealed by RAPD analysis leading to the development of ecotype-specific SCAR marker // J Hered. – 2009. – Vol. 100. – P. 338-347.

Osipova E.S., Lysenko E.A., Troitsky A.V., Dolgikh Y.I., Shamina Z.B., Gostimskii S.A. Analysis of SCAR marker nucleotide sequences in maize (Zea mays L.) somaclones // Plant Sci. – 2011. – Vol. 180. – P. 313-322.

Rahman M., Sun Z., McVetty P.B., Li G. High throughput genome-specific and gene-specific molecular markers for erucic acid genes in Brassica napus (L.) for marker-assisted selection in plant breeding // Theor Appl Genet. – 2008. – Vol. 117. – P. 895-904.

Naeimi S., Kocsubé S., Antal Z., Okhovvat S.M., Javan-Nikkhah M., Vágvölgyi C., Kredics L. Strain-specific SCAR markers for the detection of Trichoderma harzianum AS12-2, a biological control agent against Rhizoctonia solani, the causal agent of rice sheath blight // Acta Biol Hung. – 2011, Mar. — №62(1). – Р. 73-84.

Falush D., Stephens M., Pritchard J.K. Inference of population structure using multilocus genotype data: dominant markers and null alleles // Molecular Ecology Notes. – 2007. – Vol. 7. – P. 574–578.

Powel l W., Machray G.C., Provan J. Polymorphism revealed by simple sequence repeats // Trends Plant Sci. – 1996. – Vol. 1. – P. 215-222.

Chung A.M., Staub J.E., Chen J.F. Molecular phylogeny of Cucumis species as revealed by consensus chloroplast SSR marker length and sequence variation // Genome. – 2006. – Vol. 49.

Rajendrakumar P., Biswal A.K., Balachandran S.M., Srinivasarao K., Sundaram R.M. Simple sequence repeats in organellar genomes of rice: frequency and distribution in genic and intergenic regions // Bioinformatics. – 2007. – Vol. 23. – P.1-4.

Kalia R.K. Rai M.K, Kalia S., Singh R., Dhawan A.K. Microsatellite markers: an overview of the recent progress in plants // Euphytica. – 2011. – Vol.177. – P.309–334

Hoffman J.I., and Amos W. Microsatellite genotyping errors: detection approaches, common sources and consequences for paternal exclusion // Molecular Ecology. – 2005. – Vol. 14. – P.599-612.

Varshney R.K., Graner A., Sorrells M.E. Genic microsatellite markers in plants: features and applications // TRENDS in Biotechnology. – 2005. – Vol. 23. – P.48-55.

Ellis R., JM Burke. EST-SSRs as a resource for population genetic analyses // Heredity. – 2007. – Vol. 99. – P.125-132.

Saunders I.W., Brohede J., Hannan G.N. Estimating genotyping error rates from Mendelian errors in SNP array genotypes and their impact on inference // Genomics. – 2007. –Vol. 90. – P. 291-296.

Guichoux E., Lagache L., Wagner S., Chaumeil P., Le. Ger P., Lepais O., Lepoittevin C., Malausa E., Revardel E., Salin F., Petit R.J. Current trends in microsatellite genotyping // Molecular Ecology Resources. – 2011. – Vol. 11. – P. 591–611.

Schulman A.H., Flavell A.J., Ellis T.H. The application of LTR retrotransposons as molecular markers in plants // Methods in Molecular Biology. – 2004. – Vol. 260. – Р.145–173.

Kalendar R., Antonius K., Smykal P., Schulman A.H. iPBS: a universal method for DNA Wngerprinting and retrotransposon isolation // Theor Appl Genet. – 2010. –121. – Р.1419–1430.

Castro I., D’Onofrio C., Martin J.P., Ortiz J.M., De Lorenzis G., Ferreira V.O. Pinto-Carnide. Effectiveness of AFLPs and Retrotransposon-Based Markers for the Identification of Portuguese Grapevine Cultivars and Clones Mol Biotechnol. – 2012. — Vol. 52. – Р. 26–39.

Nakatsuka T., Yamada E., Saito M., Hikage T., Ushiku Y., Nishihara M. Construction of the first genetic linkage map of Japanese gentian (Gentianaceae) // BMC Genomics. – 2012. –Vol. 13. – Р. 672.

Bonin A., Bellemain E., Bronken Eidesen P., Pompanon F., Brochmann C., Taberlet P. How to track and assess genotyping errors in population genetics studies // Mol Ecol. – 2004. – Vol. 13. – P.3261-3273.

Pompanon F., Bonin A., Bellemain E.,Pierre Taberlet. Genotyping Errors: Causes, Consequences And Solutions. Genetics. – 2005. – Vol. 6. – P.847-859.

Morin P.A., Leduc R. G., Archer F. I., Martien K. K., Huebinger R., Bickham J.W., Taylor B.L. Significant deviations from Hardy–Weinberg equilibrium caused by low levels of microsatellite genotyping errors // Molecular Ecology Resources. – 2009. – Vol. 9. – P.498-504.

Gordon D., Heath S.C., Ott J. True pedigree errors more frequent than apparent errors for single nucleotide polymorphisms // Hum Hered. – 1999. – Vol.49. – P.65–70.

Gordon D., Finch S.J., Nothnagel M., Ott J. Power and sample size calculations for case–control genetic association tests when errors are present: application to single nucleotide polymorphisms // Human Heredity. – 2002. – Vol. 54. – P.22–33.

Sobel E., Papp J. C., Lange K. Detection and integration of genotyping errors in statistical genetics Am. J. Hum. Genet. – 2002. – Vol. 270. – P.496–508.

Navidi W., Arnheim N., Waterman M.S. A multiple-Tubes Approach for Accurate genotyping of very Small DNA samples by using PCR: Statistical considerations // Am. J. Hum. Genet. – 1992. – Vol. 50. – P.347-359.

Ghosh, S. et al. Methods for precise sizing, automated binning of alleles, and reduction of error rates in large-scale genotyping using fluorescently labeled dinucleotide markers // Genome Res. – 1997. – Vol. 7. – P.165–178.

Hosking L., Lumsden S., Lewis K., Yeo A., McCarthy L., Bansal A., Riley J., Purvis I., a Xu Ch-F. Detection of genotyping errors by Hardy–Weinberg equilibrium testing // European Journal of Human Genetics. – 2004. – Vol. 12. – P.395–399.

Ewen K.R., Bahlo M., Treloar S.A., Levinson D.F., Mowry B., Barlow J.W., S.J. Foote. Identification and Analysis of Error Types in High-Throughput Genotyping // Am. J. Hum. Genet. – 2000. – Vol. 67. – P.727–736.

Gomes I., Collins A., Lonjou C. et al. Hardy–Weinberg quality control. Annals of Human Genetics. – 1999. – Vol. 63. – P.535–538.

Callen D.F., Thompson A.D., Shen Y., Phillips H., Richards Rl., Mulley J.C., Sutherland G.R. Incidence and origin of ‘null’ alleles in the (AC)n microsatellite markers // Americun Jounrnl of Human genetics. – 1993. – Vol. 52. – P.922-927.

Pemberton J.M., Slate J., Bancroftt ‘D.R, Barrett J.A. Nonamplifying alleles at microsatellite a caution for parentage and population loci: studies // Molecular Ecology. – 1995. – Vol. 4. – P.249-252.

Van Oosterhout C., Weetman D., Hutchinson W. F. Estimation and adjustment of microsatellite null alleles in nonequilibrium populations // Molecular Ecology Notes. – 2006. – Vol. 6. – P.255–256.

Chapuis M.-P., Estoup A. Microsatellite Null Alleles and Estimation of Population Differentiation // Mol. Biol. Evol. – 2007. – Vol. 24. – P.621–631.

Dewoody J., Nason J.D., Hipkins V.D. Mitigating scoring errors in microsatellite data from wild populations // Molecular Ecology Notes. – 2006. – Vol. 6. – P.951–957.

Dakin E.E., Avise J.C. Microsatellite null alleles in parentage analysis // Heredity. –2004. – Vol. 93. – P.504-509.

Rungi D., Berube Y., Zhang J., Ralph S., Ritland C.E., Ellis B E., Douglas C., Bohlmann J., Ritland K. Robust simple sequence repeat markers for spruce (Picea spp.) from expressed sequence tags // Theor Appl Genet. –2004. – Vol. 109. – P.1283–1294.

Wake D.B., Wake M.H., Specht C.D. Homoplasy: From Detecting Pattern to Determining Process and Mechanism of Evolution // Science. – 2011. – Vol. 331. – P.1032-1035.

Estoup A., Jarne P., Cornuet J.-M. Homoplasy and mutation model at microsatellite loci and their consequences for population genetics analysis // Molecular Ecology. – 2002. – Vol. 11. – P.1591–1604.

O’hanlon P.C., Peakall R. A Simple method for the detection of size homoplasy among amplified fragment length polymorphism fragments // Molecular Ecology. – 2000. – Vol.9. – P.815–816.

Vekemans X., Beauwens T., Lemaire M., Roldcn-Ruiz I. Data from amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers show indication of size homoplasy and of a relationship between degree of homoplasy and fragment size // Molecular Ecology. – 2002. – Vol. 11. – P.139-151.

Caballero A., Quesada H. Homoplasy and Distribution of AFLP Fragments: An Analysis In Silico of the Genome of Different Species // Mol. Biol. Evol. – 2010. – Vol. 27. – P.1139–1151.

Herrmann D., Poncet B.N., Manel S., Rioux D., Gielly .L, Taberlet P. Gugerli F. Selection criteria for scoring amplified fragment length polymorphisms (AFLPs) positively affect the reliability of population genetic parameter estimates // Genome. – 2010. – Vol. 53. – P.302–310.

Whitlock R., Hipperson H., Mannarelli M.,. Butlin R .K, Burke T. An objective, rapid and reproducible method for scoring AFLP peak-height data that minimizes genotyping error // Molecular Ecology Resources. – 2008. – Vol. 8. – P.725–735.

Zhang H., Hare M.P. Identifying and reducing AFLP genotyping error: an example of tradeoffs when comparing population structure in broadcast spawning versus brooding oysters // Heredity. –2012. – Vol. 108. – P. 616–625.

---

Подборка по базе: Социально экономические последствия изменения природной среды.do, Социально-экономические последствия Северной войны для России.do, История.Распад СССР причины и последствия.docx, МП 2023 — Последствия хронического стресса. Эмоциональное выгора, 2.Экономические преобразования и их социальные последствия в 199, Гематурия виды, причины и диагностика_рабочая тетрадь.pdf, Занятие № 8 «Причины и механизмы развития Причины и механизмы ра, Антропогенные изменения атмосферы и их последствия. Загрязнение , отказы причины все пособия.docx, НЕГАТИВНЫЕ ПОСЛЕДСТВИЯ НАРУШЕНИЙ ПРАВИЛ ВЕДЕНИЯ БУХГАЛТЕРСКОГО У

---

 МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МАРКЕРЫ. ПРИЧИНЫ И ПОСЛЕДСТВИЯ

ОШИБОК ГЕНОТИПИРОВАНИЯ

 М.Е. Омашева, К.П. Аубакирова, Н.А. Рябушкина

РГП «Институт биологии и биотехнологии растений», г. Алматы

natrya7@yahoo.com

 АБСТРАКТ

Молекулярные маркеры, в основу которых положена реакция гибридизации или этап ПЦР, выявляющие полиморфизм ДНК, используются в настоящее время в различных областях биологии, в том числе в изучении и сохранении генетического разнообразия, идентификации индивидуумов, филогенетике, картировании полезных признаков качества и устойчивости к стрессовым факторам, в селекционном процессе, биотехнологии и др. До начала эксперимента исследователи должны определить, какой тип маркеров использовать исходя из следующих критериев: вариабельность и количество требуемых маркеров, необходимость в их кодоминантности, соответствующие требования к выделяемой ДНК; практические – эффективность, воспроизводимость анализа, необходимое соответствующее техническое обеспечение и стоимость. Для корректной интерпретации результатов генотипирования следует учитывать тот факт, что применение любого типа молекулярных маркеров сопряжено с рядом ошибок генотипирования, главные из них – выпадение бóльших аллелей, «нуль» аллели, «stutter» аллели вследствие особенностей Таг-полимеразы, негомологичность амплифицированных последовательностей одинакового размера (гомоплазия). Исследователи формулируют определяющие условия для уменьшения количества ошибок при генотипировании и снижения их влияния на конечный анализ. В их числе качество и количество анализируемой ДНК, уровень технических возможностей и профессионализма персонала, поскольку человеческий фактор определяется как одна из главных причин некорректных результатов; проведение пилотных экспериментов для сравнительной оценки теоретического и реального коэффициента ошибки. Минимизирование ошибок достигается оценкой возможностей того или иного типа и скринингом маркеров; оптимизацией экспериментальных методов, надлежащим использованием контролей, повторностей, а также разработкой статистических подходов для выявления ошибок. Компромисс между выбраковкой локусов, порождающих ошибки и повышением потенциала оставляемых локусов для усиления генетического сигнала может быть различным в различных исследованиях, но главное, чтобы этот сигнал не был потерян в угоду «приемлемого» уровня ошибок и исследователи разрабатывают эмпирические подходы для достижения желаемого компромисса.

Ключевые слова: молекулярные маркеры, генотипирование, ошибки генотипирования.

РАЗНОВИДНОСТИ И ОСОБЕННОСТИ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ

Прогресс в современной биологии в значительной степени базируется на развитии и использовании молекулярно-генетических подходов, в основе которых лежит анализ полиморфизма ДНК, выявляемый с помощью различных типов молекулярных маркеров. Молекулярные маркеры используются в настоящее время для генотипирования при оценке генетического родства/разнообразия между индивидами, сортами, для создания генетических карт, картирования генов интереса, в селекционном процессе (MAS, marker assisted selection), популяционной генетике, филогенетических исследованиях, биотехнологии и др. [1-5].

Эволюция молекулярных маркеров идет в направлении повышения разрешающей способности, быстроты, простоты и, по возможности, снижения стоимости анализа. Исследователями [6] сформулированы требования к ДНК маркерам, согласно которым идеальный молекулярный маркер должен отвечать комплексу характеристик: быть высоко полиморфным для выявления генетического разнообразия; иметь кодоминантное наследование, позволяя определять гомозиготное и гетерозиготное состояния диплоидных организмов; маркер должен случайно и часто быть распределен по геному; его проявление должно быть нейтральным (поскольку ДНК последовательности любого организма нейтральны к внешним условиям и осуществляемым процедурам); метод должен быть прост и дешев в использовании; высоко воспроизводим; должен позволять обмен результатами между лабораториями. Наличие нескольких типов маркеров объясняется тем, что ни один из них с высокой степенью не соответствует всей сумме перечисленных критериев. При этом очевидно, что особенности той или иной разновидности молекулярных маркеров обуславливают их более успешное применение для решения тех или иных задач. Исследователи перед началом эксперимента должны определить, какой тип маркеров использовать исходя из следующих критериев: вариабельность и количество требуемых маркеров, необходимость в их кодоминантности, соответствующие требования к растительному материалу и выделяемой ДНК, размер генома и плоидность таксона; практические – эффективность анализа, стоимость и соответствующее техническое обеспечение [7]. Более того, тенденцией современных исследований с привлечением молекулярных маркеров является использование двух и более типов маркеров (описание типов см. ниже), что приводит к более однозначным, достоверным результатам. Так, для понимания механизмов устойчивости V. amurensis к Agrobacterium с помощью RAPD маркеров в картирующей популяции винограда был выявлен локус устойчивости, на основе которого были разработаны сопряженные с устойчивостью SCAR маркеры. Однако, точную локализацию этих маркеров удалось выяснить с помощью SSR маркеров с использованием референсной карты [8].

В последние десятилетия разработаны типы молекулярных маркеров, в основу которых положена реакция гибридизации, таких как RFLP, и несколько типов, включающих этап ПЦР (RAPD, AFLP, SSR, SNP, CAPS, SCAR, маркеры на основе ретротранспозонов и др.). В обзоре [6] приведен список наиболее часто используемых молекулярных маркеров, приложения их использования, преимущества и недостатки, а также сравнительная оценка, основанная на ряде признаков. В их числе: требования к количеству и качеству ДНК, количество анализируемых полиморфных локусов, простота использования, возможность автоматизации процесса, воспроизводимость и стоимость.

Ниже приведены наиболее часто используемые типы молекулярных маркеров.

 RFLP (restriction fragment length polymorphism; полиморфизм длины рестрикционных фрагментов) – первый метод молекулярных маркеров для профилирования ДНК. Метод основан на технике расщепления с помощью особых рестрикционных ферментов (эндонуклеаз рестрикции) молекул ДНК, различающихся в гомологичных участках и соответственно мест рестрикции, и сравнении длин полученных фрагментов различных видов и даже линий живых организмов. Полученные фрагменты разделяются электрофоретически. После переноса на мембрану они идентифицируются гибридизацией с радиоактивно мечеными пробами (Southern blotting). Гибридизация позволяет определять длины фрагментов, комплементарных пробам. Каждый фрагмент рассматривается как аллель и используется в генетическом анализе. Достаточная степень полиморфизма, кодоминантность, частота и равномерное распределение по геному, высокая воспроизводимость позволили использовать метод в ДНК профилировании, картировании генома, локализации генов, имеющих отношение к болезням, генотипировании, изучении филогенеза. Согласно PubMed данным (plant+RFLP), максимальное количество публикаций с использованием этих маркеров приходится на 2003-2005 гг. Определенные недостатки метода – необходимость больших количеств ДНК высокого качества, использование изотопов, продолжительность анализа и др. Соответствующее развитие более эффективных и дешевых типов маркеров к настоящему моменту существенно снизили использование RFLP анализа.

 Маркеры с использованием полимеразной цепной реакции (PCR)

PCR (polymerase chain reaction; ПЦР, полимеразная цепная реакция) – использование термостабильной ДНК полимеразы для амплификации in vitro отдельных/специфических последовательностей или локусов ДНК с применением случайных или специфических праймеров (олигонуклеотидных последовательностей). Амплифицированные фрагменты разделяются электрофоретически и полосы (пики) выявляются окрашиванием или радиоавтографией. Предпочтение методов генотипирования с использованием ПЦР обусловлено, прежде всего, потребностью в реакции небольших количеств ДНК (5-100 нг образца на реакцию).

Открытие и разработка полимеразной цепной реакции создали возможности для дизайна широкого спектра молекулярных маркеров. Развитием RFLP анализа явился метод CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence) – амплификация в ПЦР последовательностей, вырезаемых по месту рестрикции соответствующих узнаванию рестриктазой нуклеотидных последовательностей полиморфных гомологичных участков. Различия проявляются в легко различимых по длине продуктов — фрагментов ДНК при электрофорезе. CAPS маркеры являются кодоминантными и позволяют выявлять полиморфизм в большом количестве индивидуумов. Например, разработка CAPS маркеров на основе последовательностей определенных генов и EST последовательностей позволила исследователям создать соответствующие пары праймеров, с помощью которых была установлена подлинность 67 сортов чая (95%), культивируемых в Японии [9]. Данный тип маркеров помогает выявлению недавней эволюционной истории, пониманию направления эволюционного процесса, обуславливающего видообразование [10]. Разработка и использование CAPS маркеров способствует более точному картированию генов интереса, в том числе устойчивости к патогенам [11, 12].

RAPD (random amplified polymorphic DNA; амплифицируемые ДНК фрагменты) – метод амплификации ДНК сегментов с использованием случайных праймеров (примерно 10 нуклеотидов) не требует предварительного знания последовательности ДНК, однако вследствие стохастической природы ДНК амплификации важна оптимизация и поддержание соответствующих условий для получения воспроизводимых результатов. Метод используется, например, для изучения близкородственных видов и молекулярной идентичности растений, размножаемых in vitro [13, 14, 15]. Недостатками метода являются: доминантность, не очень хорошая воспроизводимость и необходимость высокоочищенной неконтаминированной ДНК, поскольку использование коротких случайных праймеров может приводить к амплификации фрагментов различных организмов; локус-неспецифичность маркеров и негомологичность фрагментов одинакового размера (homoplasy). Вследствие недостаточной воспроизводмиости RAPDs сложно использовать в межлабораторных исследованиях. Вследствие вышеупомянутого значимость получаемых результатов и их интерпретация могут подвергаться сомнению.

На основе полученных с использованием случайных праймеров RAPD бэндов, их разделения, экстрагирования, клонирования и секвенирования и дизайна специфических праймеров разработан тип маркеров SCAR (sequence characterized amplified region, характерная последовательность амплифицируемого участка), развитие и использование которых экспоненциально растет с начала 1990-х годов. Так, разрабатываются специфические SCAR маркеры, позволяющие дискриминировать определенные молекулярные фенотипы различных видов одного рода [16], используемые в таксономии [17] дискриминирование экотипов [18], выявление уникальных сомаклональных вариантов и молекулярных событий, сопряженных с вариабельностью сомаклонов [19]. Подобный тип маркеров обладает потенциалом, в селекции [20] позволяет различать определенные патогенные штаммы микроорганизмов [21] и др.

AFLP (amplified fragment length polymorphism; амплификация полиморфных по длине фрагментов ДНК) – метод селективной ПЦР амплификации полиморфных по длине фрагментов, полученных в результате энзиматического расщепления геномной ДНК эндонуклеазами рестрикции. К полученным после рестрикции фрагментам для селективной амплификации «пришиваются» олигонуклеотидные адаптеры. Таким образом, праймеры состоят из адаптера и последовательности нескольких нуклеотидов (1-5), специфичных для узнавания ферментом рестрикции. Полиморфизм фрагментов по длине (обычно несколько десятков на реакцию), обусловленный множеством геномных сайтов рестрикции, выявляется при электрофорезе. Воспроизводимость и высокое количество информативных фрагментов в реакции позволяет использовать метод в различных аспектах: изучение генетической идентичности, идентификация сортов и клонов, филогенетические связи, картирование, MAS и др. Реализация метода требует высокого качества ДНК. Хотя использование AFLPs, как и RAPDs, не требует предварительного знания ДНК последовательностей, эти типы маркеров сложно использовать при изучении различных популяций или даже видов. Недостатками AFLPs являются доминантность аллелей, возможная негомологичность одинаковых по длине фрагментов – гомоплазия. В случае вставки между соседними местами рестрикции наблюдается утрата короткого фрагмента и появление более длинного. При использовании доминантных маркеров, например, в диплоидах один бэнд имеет место в случаях, если одна или обе гомологичные хромосомы содержат амплифицируемую последовательность, т.е. невозможно различить гомо- и гетерозиготы. В полиплоидах неясность усугубляется, поскольку даже в случае выявления определенного бэнда тем более трудно сказать, в каком количестве аллель присутствует [22]. Тем не менее, использование AFLP маркеров в течение последнего десятилетия (PubMed) практически не снижалось. Метод используется при изучении эволюционных и экологических аспектов живых организмов, при сохранении видов.

Микросателлиты (SSR, simple sequence repeat; тандемы повторов простых последовательностей) – участки ДНК, состоящие из тандемов повторяющихся единиц: моно-, ди-, три-, тетра- или пента-нуклеотидов [23]. Микросателлиты присутствуют как в некодирующих, так и в кодирующих областях генома, а также в хлоропластном [24] и митохондриальном геномах [25]. Естественными причинами разнообразия в количестве повторов единиц микросателлитов в геноме являются «проскальзывание» (slippage) полимеразы в ходе репликации ДНК, и/или несоответствующий кроссинговер, несовпадение/восcтановление повреждений двойной нити ДНК, а также перемещения ретротранспозонов. Эти вариации приводят к полиморфизму по длине фрагментов, выявляемых при электрофорезе [26]. Этот тип генетических маркеров приобрел в последнее десятилетие большую значимость благодаря комплексу свойств: гипервариабельность, мультиаллельная природа, кодоминантное наследование, высокая воспроизводимость, относительное обилие, экстенсивное распределение по геному, высокая пропускная способность, податливость автоматизации процесса. Микросателлиты используются при изучении филогеографии, структуры популяций, сортовой идентификации, выявлении источника происхождения (отцовства).

По сравнению с SSR использование RAPD недостаточно воспроизводимо, тогда как RFLP не обладают высокой пропускной способностью, а AFLP осложнен тем, что индивидуальные полосы могут состоять из нескольких фрагментов, идентичных по размеру, особенно в больших геномах. Хотя и для SSR гомоплазия, связанная с высокой скоростью мутаций и возможностью обратных мутаций, может быть определенной проблемой. Одним из недостатков SSR маркеров является стоимость их разработки, поскольку для создания праймеров необходимо клонирование и секвенирование произвольных участков ДНК, выявление микросателлитных повторов и определение фланкирующих областей таких участков генома для определения специфического локуса. Микросателлиты могут быть разработаны на основе геномных библиотек ДНК или библиотек, обогащенных для специфических микросателлитов. Некоторые микросателлиты могут быть не просто ди-, три-, или тетра-повторами, а составными повторами, в которых возможен полиморфизм по одному нуклеотиду. Эти аллели различаются на 1 пару нуклеотидов и требуют особого внимания при генотипировании. Аллельные различия в размерах микросателлитов, на которых и основано их использование, в то же время могут обусловить ошибки при амплификации и, соответственно, ошибочной интерпретации генотипирования при оценке генетического разнообразия, структуры популяций, родословной и др. Исследователи показали, что количество ошибок при использовании микросателлитов прямо коррелирует с размером ПЦР продукта [27].

EST-SSR (ESTs, expressed sequence tag, короткие фрагменты последовательностей клонированных участков ДНК (mRNA→cDNA)), которые используются для идентификации транскриптов генов, могут быть источниками для выявления SSRs, т.е. для поиска микросателлитов в экспрессируемых участках генома [28]. Поскольку EST последовательности консервативны, межвидовая EST-SSRs ПЦР амплификация, возможно, более успешна, чем SSRs геномной ДНК. Этот тип маркеров представляет интерес, поскольку их разработка недорога, они отражают транскрибируемые гены, чьи предполагаемые функции зачастую могут быть определены с помощью выявления гомологии. Но качество SSR-EST последовательностей очень важно, поскольку дизайн праймеров может быть осложнен рядом обстоятельств: распространением одного или обоих праймеров на участки сплайсинга; наличием больших интронов в последовательности геномной ДНК, использованием «неполноценной» (questionable) информации относительно создания праймера, и созданием праймеров для химерных cDNA клонов. Таким образом, дизайн праймеров успешен на 60-90%. К началу 2013 г. в базах данных (GenBank) доступны более 74 млн. ESTs. Однако создание генных микросателлитных маркеров ограничено теми видами, для которых имеется достаточно большое количество ESTs. С помощью определенных компьютерных программ данные последовательностей ESTs, генов и cDNA клонов могут быть загружены из GenBank и сканированы на выявление SSRs [табл. 1 в 28]. Приложения использования данного типа маркеров – функциональный геном, ассоциативное картирование, анализ генетического разнообразия, анализ количественных признаков и др. EST-SSR маркеры могут способствовать эволюционному анализу широкого представительства таксонов, анализу видов, ресурсы которых крайне ограничены [29]. Продуктами EST-SSR маркеров являются четкие бэнды, отчетливые аллельные пики [28]. Поскольку эти маркеры являются производными транскриптов, они могут быть использованы для оценки функционального разнообразия естественных популяций или коллекций гермоплазмы. Особенно в случаях маркирования генов, ответственных за фенотипические признаки, эти маркеры полезны для использования в селекции. Как было упомянуто выше, на основе EST-последовательностей разрабатываются и CAPS маркеры.

ISSR (inter-simple sequence repeat, область генома между двумя соседними, противоположно ориентированными микросателлитами) – в качестве праймеров используется последовательность сердцевинной части микросателлита с несколькими (1-3) нуклеотидами, примыкающими к тандему повторностей. Десятки фрагментов множества локусов, полученных в ПЦР, разделяются электрофорезом и оцениваются на присутствие или отсутствие (вследствие доминантности маркеров) фрагментов определенного размера. Главное преимущество данного типа маркеров – отсутствие необходимости знания последовательностей при конструировании праймеров. Следует учитывать, что вследствие мультилокусности возможна гомоплазия. Маркеры данного типа используются для выявления генетической идентичности, родословной, дифференциации клонов, микроклонов и линий, таксономии близкородственных видов.

SNP (single-nucleotide polymorphism; полиморфизм по одному нуклеотиду) – маркеры данного типа становятся все более используемыми в исследованиях генома. Техника основана на том, что в организмах изменения в одном нуклеотиде приводят к точечным мутациям, обуславливая тем самым полиморфизм по одному нуклеотиду (диаллельный тип маркеров). Для создания специфических праймеров необходимо знание последовательностей и фланкирующих областей. Несмотря на высокую стоимость, использование метода в последние годы возрастает. Поскольку метод позволяет автоматизированно осуществлять высокоразрешающее генотипирование с одновременным использованием большого количества SNP маркеров; присутствие многих тысяч проб на чипе позволяет одновременно анализировать множество SNPs. Но в то же время различие аллелей только по одному нуклеотиду и множество проб делает невозможным создание оптимальных условий гибридизации для всего массива проб. Это в ряде случаев приводит к гибридизации анализируемой ДНК с несоответствующими пробами. Оценка большого объема данных становится серьезной проблемой, так как не представляется возможным предпринять point-by-point оценку обоснованности тех или иных данных [30].

Поскольку применение SSR и SNP маркеров постоянно возрастает, исследователи провели сравнительную характеристику этих двух типов маркеров [31]. Так SSRs имеют следующие преимущества перед SNPs. В SSR локусах превышение на определенное количество повторностей может рассматриваться как полиморфизм, в то время как для идентификации SNPs гомологичных областей должны быть сиквенированы области многих хромосом. SSRs обладают несущественной необъективностью, т.е. оценка полиморфизма с их помощью не зависит от исходного перечня сортов. Успех SSR амплификации близкородственных сортов выше, чем для SNP. Локусы SSRs более действенны для выявления смесей, чем SNPs. Достоверность SSR генотипирования оценить легче, поскольку бóльшая доля ошибок может быть выявлена при анализе родословной, когда имеет место много аллелей на локус, тогда как для биаллельных SNPs многие ошибки при анализе не выявляются, поскольку они следуют правилам Менделевского наследования. Очевидно, имеют место и недостатки SSR по сравнению с SNP. Так, большое количество аллелей на SSR локус подразумевает анализ большого количества образцов. Более частые спонтанные SSR мутации внутри родословной потенциально осложняют реконструкцию происхождения; обратные мутации затрудняют описание длительной истории популяций. Вариабельность высокополиморфных микросателлитов может некорректно отражать геномное разнообразие. Микросателлиты требуют включения контролей, в то время как использование SNPs может осуществляться параллельно в ряде лабораторий без необходимости калибровки результатов.

Очевидно, что разработка и использование различных типов молекулярных маркеров основаны на выявлении изменений в геномных последовательностях, что в свою очередь предполагает, в том числе, экстинцию (выпадение) и последующую вставку последовательностей ДНК. Причиной этих событий могут быть ретротранспозоны (РТ). РТ являются неотъемлемой и довольно значительной частью генома всех живых организмов. Маркеры на основе РТ успешно используются для анализа генетических взаимосвязей, филогенеза, видового разнообразия, при создании генетических карт и идентификации генов [32, 33, 34, 35]. Вездесущая природа РТ и вовлеченность в создание геномного разнообразия посредством интеграции больших сегментов ДНК в рассредоточенные локусы хромосом делают их идеальными для создания на этой основе нескольких типов молекулярных маркеров. Так, IRAP (inter-retrotransposon amplified polymorphism) генерирует ПЦР продукты между двумя близлежащими РТ. REMAP (retrotransposon-microsatellite-amplified polymorphism) использует один LTR (long terminal repeat) праймер и другой «присоединенный» к 3’концу SSR последовательности, выявляя РТ, интегрированные поблизости этой SSR последовательности. iPBS амплификация основана на присутствии в сайте связывания праймера обратной транскриптазы в области LTR РТ. SSAP (sequence-specific amplified polymorphism) является производным AFLP, амплифицируя продукты между местом интеграции РТ и местом рестрикции, к которому «привязан» адаптер.

Каждое злокачественное новообразование уникально, как и любой живой организм.

Эта уникальность состоит в индивидуальном наборе характеристик, которые сами по себе уникальными не являются.

Эти характеристики придают особые свойства каждой опухоли. Программа онкологического генотипирования изучает каждую характеристику в отдельности, складывая уникальный «портрет» каждой опухоли и соотносит его с особенностями организма пациента.

Кому показано генотипирование?

Генотипирование необходимо, если:

• Требуется максимально полная картина заболевания;
• Исчерпаны возможности стандартной терапии или прогноз опухоли изначально плохой;
• Требуется выбрать один из множества таргетных препаратов (для лечения рака легкого, рака прямой и ободочной кишки, меланомы и других);
• Диагностирован редкий вид опухоли или опухоль с невыявленным первичным очагом.

Для чего это нужно?

Точные знания об опухоли и организме пациента открывают возможности, которые ещё недавно были недоступны:

• Подбор уникального лечения для существующей опухоли;
• Точная оценка эффективности текущего лечения;
• Подбор нового протокола лечения, если опухоль перестала отвечать на текущий протокол;
• Определить риск развития опухоли у здорового человека.

Подбор уникального лечения для существующей опухоли

Молекулярное профилирование опухоли — расширенная молекулярная диагностика для подбора противоопухолевой терапии с учетом выявленных индивидуальных особенностей пациента. Тестирование включает в себя патоморфологическое исследование, генетический анализ методом секвенирования (NGS), ИГХ-исследования и другие современные методы:

• Оценка потенциальной эффективности 347 препаратов;
• Анализ до 415 генов;
• Включение в 455 клинических исследований в России и за рубежом.

Точная оценка эффективности текущего лечения

Выполнив молекулярное исследование, пациент получает развернутую информацию, необходимую врачу для принятия решение о выборе терапии:

• Оценка эффективности химиотерапевтических, иммуно- и таргетных препаратов;
• Подбор клинических исследований и экспериментального лечения на основе молекулярных особенностей опухоли;
• Выявление повышенной токсичности химиотерапии на основании фармакогенетических маркеров;
• Верификация морфологического заключения, в том числе определение первичного очага при необходимости.

Определить риск развития опухоли у здорового человека

Генетическое исследование, которое позволяет выявить мутации в более чем 90 генах, связанных со всеми известными наследственными онкологическими заболеваниями.

По различным данным, от 7% до 10% случаев онкологических заболеваний обусловлены наличием генов предрасположенности к их развитию, и, соответственно, представляют собой наследственные формы рака. Наиболее часто встречаются наследственные формы рака молочной железы, яичников, легкого, рак желудка, толстого кишечника, меланомы и других.

Можно выделить несколько ключевых способов управления рисками по результатам генетического тестирования:

1. Персонализированная программа скрининга. Например, женщинам с некоторыми мутациями в гене BRCA1 рекомендованы регулярные МРТ молочных желез для контроля над развитием РМЖ. А носителям нарушений в гене STK11 — раннее начало колоноскопического скрининга.
2. Знание своих рисков помогает детям и родственникам. Наследственные мутации передаются от родителей детям, поэтому знание собственных генетических особенностей, даже если болезнь уже реализовалась, помогает вовремя начать профилактику у детей или родственников.
3. Активная профилактика. Наследственность всегда — только один из факторов развития онкологического заболевания. В отличие от генетических нарушений, многие другие риски можно снизить. Например, знание о носительстве «рискованной» мутации помогает людям начать более здоровый образ жизни: избавиться от лишнего веса, бросить курить или «долечить» хронические инфекции (как известно, бактерия H.pilori, вызывающая гастрит, может стать причиной рака желудка). В некоторых особенно сложных случаях может быть рекомендовано превентивное лекарственное или хирургическое лечение. Однако, как правило, обходится без радикальных вмешательств.

Генотипирование выявляет основные мутации предрасположенности к возникновению рака молочной железы и рака яичников.

Молекулярные исследования показали, что наследственный рак молочной железы у молодых женщин этиологически связан с геном BRCA1, BRCA2, ATM и CHEK2. Наследуемые мутации в этих генах ассоциированы с возникновением рака молочной железы и у мужчин, а также ответственны за семейный рак яичника. Наличие вышеуказанных мутаций повышает риск рака молочной железы в течение жизни (до 75 лет) до 90–95%, а рака яичников — до 40–50%.

Как выполняется генотипирование?

Молекулярное профилирование опухоли выполняется по тем же материалам, которые берутся для обычного гистологического исследования — это образцы тканей. Взятый образец сохраняется при помощи стандартных методов — в виде гистологических стёкол или парафиновых блоков — и отправляется в сертифицированную лабораторию (EMQN, NORDIQC).

В лаборатории выполняется весь перечень исследований, результаты которых отправляются врачу, сделавшему запрос. Исходя из полученных результатов, доктор составляет подробный план лечения.

Показания к генотипированию опухоли:

• Cемейная история случаев рака молочной железы или яичников, рака простаты или поджелудочной железы;
• Частые воспалительные и диспластические процессы (мастопатия, эндометриоз, воспалительные заболевания женских половых органов);
• Сочетание факторов риска (например, ожирение, вредные привычки).

Результат

В результате исследования, ожидается назначение наиболее эффективных лечебных мер. Подбирается необходимый метод лечения, наиболее подходящий препарат или комплекс препаратов, с прогнозируемым результатом лечения.

В некоторых случаях значительно ускоряется процесс угнетения опухолевых клеток. Также появляется возможность не только предвидеть развитие опухоли, но и принять меры по её профилактике, либо обнаружить её на нулевой стадии, что стремительно увеличивает вероятность положительного прогноза.

В целом, доступность этого исследования может кардинально изменить онкологическую обстановку в мире. Результаты, которые врач получает в итоге исследования представляют собой не только бесценные вводные данные для лечения, но и новый образец опухоли, данные о которой вводятся в электронную систему. Система систематизирует и сохраняет данные об особенностях опухоли, что позволяет ещё точнее определять характер онкологических новообразований в будущем. Таким образом, каждый новый образец — это инструмент для сравнения и точного профилирования всех известных форм и видов опухоли.

Молекулярные маркеры. причины и последствия ошибок генотипирования

@inproceedings{2013,
  title={Молекулярные маркеры. причины и последствия ошибок генотипирования},
  author={М Омашева and К.П. Аубакирова and Н. Рябушкина},
  year={2013}
}