Цитологические исследования могут быть ошибки

Ежегодно в России тысячи лабораторий выполняют миллиарды анализов. Но есть ли гарантия, что результаты ваших лабораторных исследований правдивы?

Ошибки бывают разные: от неправильно определенного уровня гемоглобина до неверной интерпретации цитологического материала. Достоянием гласности становятся только ошибки, повлекшие очень серьезные последствия. Так, например, у 33-летней женщины в результате ошибки лаборанта не было установлено наличие злокачественной опухоли на ранней стадии, хотя она сделала все рекомендованные врачом исследования. Она успокоилась, но, когда опухоль обнаружили, было уже поздно…

Большинство ошибок, к счастью, не влечет сколько-нибудь серьезных последствий. Вы можете и не догадаться об ошибке. Например, если результат анализа показывает низкий уровень гемоглобина, вы просто включаете в рацион богатые железом продукты и железосодержащие пищевые добавки, и повторный анализ показывает, что гемоглобин — в норме. Но даже если результат первого анализа был ошибочным, вы просто съели лишнего «железа».

Где подстерегают ошибки?

Лабораторное исследование состоит из трех частей: преаналитической (от подготовки пациента до момента поступления биоматериала в работу), собственно аналитической и постаналитической (от момента, когда материал покидает прибор, до выдачи результатов пациенту). И на каждом из этих этапов может случиться ошибка.

1. Ошибка может быть заложена уже вначале, при оформлении заказа на исследования. Нa этот этап приходится более половины всех ошибок. Медсестра может неправильно или неразборчиво написать фамилию пациента, перепутать направления на анализы или пробирки.

2. Ошибка может случиться непосредственно во время проведения анализа. В лабораториях, где используют устаревшие методы исследований, вероятность таких ошибок выше. Они не предполагают использования одноразовой лабораторной посуды, многие операции выполняются вручную. Но в оснащенных современными приборами лабораториях вероятность ошибки при проведении исследований практически исключена.

3. Ошибка возможна при интерпретации исследований цитологических и гистологических материалов. В этих случаях применяется исключительно экспертная опенка, то есть врач изучает материал под микроскопом. Есть вероятность, что он «не разглядит» те или иные изменения в клетках или тканях пациента или неверно истолкует их.

4. Виновниками ошибок могут стать сбои в работе приборов.

5. Существует вероятность переноса микроскопических частиц биоматериала из одной пробы в другую, хотя она и очень мала.

Как себя обезопасить?

— Проходите лабораторные исследования только в государственных медицинских учреждениях или коммерческих лабораториях, имеющих лицензию на медицинскую деятельность. Если она не вывешена в рамочке в приемном отделении, попросите показать ее. О высоком качестве работы учреждения свидетельствует и его многолетнее присутствие на рынке медицинских услуг.

— Не стесняйтесь проверять, правильно ли медсестра написала вашу фамилию, инициалы, дату рождения. Проследите, чтобы именно ваши фамилия и имя, идентификационный номер или уникальный штрих-код были нанесены на вашу пробирку.

— Если исследования проводились в рамках диспансеризации или, например, для получения медицинской справки, а результаты показали отклонения от нормы, стоит обратиться к врачу. Он оценит, насколько существенны эти отклонения, и направит на повторные исследования через семь-десять дней. Если отклонения будут зафиксированы вновь, он назначит углубленные исследования.

— Если у вас обнаружены клинические признаки того или иного заболевания, а лабораторные исследования не подтверждают это, то вы можете в индивидуальном порядке вновь провести исследование из того же материала.

— Особый случай — гистологические и цитологические исследования, требующие экспертной оценки. В одних материалы исследуют два врача, в других — один врач, но все сложные и сомнительные случаи отправляются на версификацию в медицинское учреждение, с которым у лаборатории заключен договор.

— Если обнаружен положительный результат на такие социально значимые инфекции, как ВИЧ или гепатит, лаборатория, согласно действующему законодательству, обязана провести подтверждающий тест из того же материала. Пациенту должны сообщать о результатах исследований только после того, как получен окончательно подтвержденный ответ.

Наш эксперт Елена Анатольевна Кондрашева, директор технологического департамента лаборатории INVITRO:

Больше всего ошибок случается при оформлении заказа на исследование. Автоматизация этого процесса может свести такого рода ошибки практически к нулю. На этом этапе сотрудник лаборатории формирует заказ и присваивает ему уникальный штрих-код. Все данные о клиенте тут же в его присутствии вносятся в информационную систему. Штрих-код приклеивается к пробирке и с этой пробиркой клиент идет в процедурный кабинет. В дальнейшем во все приборы пробирка попадает с этим штрих-кодом. Современное оборудование позволяет в 99% случаев использовать «первичную пробирку», т.е. биоматериал, например кровь, не переливается из одной большой пробирки, как было раньше, по нескольким маленьким. Все автоматизировано: пробирка «переезжает» в приборе от одного анализатора к другому, который считывает штрих-код. Таким образом, изначально правильно оформленные пробирки перепутать уже невозможно.

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Московский научно-исследовательский онкологический институт имени П.А. Герцена

На правах рукописи

ЕРМОЛАЕВА Анна Георгиевна

УДК 616-0066-0765

ОШИБКИ

ЦИТОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ РАКА ОСНОВНЫХ ЛОКАЛИЗАЦИЙ И ПУТИ ИХ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ

14.00.14 —онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва — 1995

Работа выполнена в отделении патоморфолопш опухоле! (руководитель — доктор медицинских наук, профессор Г.А.Франк Московского научно-исследовательского онкологического инсти тута имени П.А.Герцена (директор — академик РАМН, профессор В.И.Чиссов)

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор К.А.Агамова

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор А.СЛетрова доктор медицинских наук, профессор А.Х.Трахтенберг

Ведущее научное учреждение — Российский государственный

медицинский университет

Защита состоится 1995 г. в часо!

на заседании диссертащюнного совета Д.084.17.01 при Московском научно-исследовательском онкологическом институте им. П.А.Герцена (125284, Москва, 2-ой Боткинский проезд, дом 3).

Автореферат разослан «_ Ц » Ц^М^М 1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук,

профессор И.А.Максимов

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

Цитологический метод диагностики рака и нераковых заболеваний широко используется в клинической практике. Область его применения не ограничивается выявлением рака при обследовании больных, обращающихся в лечебные учреждения, и при профилактических осмотрах, а включает в себя такие ответственные разделы, как проведение срочных цитологических исследований во время хирургических вмешательств для суждения о характере процесса, его распространенности, абластичности операционных разрезов при раке, определении гистологической формы опухоли, степени ее диф-ференцировки и ряд других задач. Современное состояние цитологической диагностики свидетельствует о том, что она призвана давать суждение о характере патологии на уровне гистоморфологи-ческой характеристики не только при оуухолях, но и при других заболеваниях. Все это предъявляет к цитологическому методу особенно высокие требования.

Между тем известно, ,что цитологический метод диагностики не лишен ошибок и недостатков, которые могут серьезно отразиться на выборе тактики в отношении больных и, в первую очередь, назначении наиболее рационального лечения. По данным различных авторов, цитологические ошибки и неудачи могут достигать 2Ъ%.

Ошибки при цитологических исследованиях в литературе освещены, как правило, с точки зрения количественного анализа расхождений цитологических и гистологических данных. Почти нет исследований по систематизации цитологических ошибок с учетом причин, их вызывающих, и о путях их устранения или предотвращения. По-видимому, этим объясняется отсутствие тенденции к снижению числа цитологических ошибок за последние 10-15 лет.

— 2 — ‘

Учитывая большую практическую значимость метода цитологической диагностики, следует считать, что настоящее исследование, посвященное его разработке и совершенствованию, является актуальным.

Актуальность настоящей работы определяется тем, что в ней впервые проведена систематизация цитологических ошибок с анализом причин, их порождающих, учетом характера ошибок, созданы дифференциально-диагностические цитологические схемы с целью возможного снижения числа ошибок, показан универсальный характер цитологических ошибок при некоторых гистологических формах рака, разработаны дополнительные методические подходы к применению морфологических и некоторых -иммуноцитохимических исследований для анализа причин ошибок и «поиска путей их предупреждения.

ЦЕЛЬ ИССЗДОВАНШ

Повышение эффективности цитологической диагностики рака основных локализаций путем снижения числа цитологических ошибок в результате разработки дифференциально-диагностических вдто-морфологических схем для внедрения в практическую работу цдто-логов.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Определить частоту и причины цитологических ошибок при раке и нераковнх поражениях.

2. Систематизировать цитологические ошибки с учетом их характера и причин, их вызывающих, при различных патологических процессах.

3. Создать дифференциально-диагностические цитологические схемы с отбором цатоморфологических признаков, способствующих устранению ошибок.

— 34. Изучить возможности использования некоторых цитоморфометри-ческих и иммуноцитохимических методов для снижения числа ошибок.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые на большом фактическом материале (II 365 цитологических исследований у 3893 больных) проведена систематизация ошибок цитологической диагностики рака и нераковых заболеваний

при локализации в легких, средостении, пищеводе,..желудке, мо»

лочной железе, шейке и теле матки. Установлены: объективные, субъективные, технические причины ошибок. По характеру ошибки разделены на ложноотрицательные по раку, ложноположательные, ошибки при определении гистогенеза, гистологической форлн опухоли, специфичности воспалительного процесса. Установлено, что объективные причины ошибок носят принципиальный характер и обусловливаются, главным образом, отсутствием патогномоничных цитологических признаков злокачественности клетки, то есть недостаточно обоснованными принципами цитологической диагностики рака и других злокачественных опухолей. Установлен универсальный характер цитологических ошибок при дифференциальной диагностике высокодифференцированных аденокарцином и тяжелых дисплазий (атипических гиперплазий) железистого эпителия вне зависимости от локализации процесса. Разработаны дифференциально-диагностические цитологические схемы, применение которых способствует повышении показателей достоверности, эффективности, чувствительности и специфичности цитологического метода. Показано, что дополнительно при цитологическом исследовании для снижения числа ошибок успешно могут быть использованы морфометраческоэ определение ядерно-цитоплазмеиного отношения и результаты иммуноцито-

химического выявления раково-эмбрионального антигена (РЭА) при исследовании асцитической и плевральной жидкостей.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

На основе изучения причин цитологических ошибок разработаны пути возможного их предупредивши. Для практического использования предлагаются дифференциально-диагностические цитологические схемы с описанием клеток и особенностей цитограмм. Показана целесообразность цитоморфометркческого определения ядерно-датоплазмеиного отношения в дифференциальной диагностике высо-кодифференцированных аденокащином и тяжелых дисплазий (атипических гиперплазий) железистого эпителия, а также иммуноцитохи-мической реакции выявления РЭА для обнаружения раковых клеток в асцитической и плевральной жидкостях. Полученные результаты способствуют повышению достоверности, эффективности, чувствительности и специфичности цитологического метода.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Апробация работы состоялась 13 октября 1994 года на совместной конференции отделений патоморфологии опухолей, торакальной, пищеводной, абдоминальной, общей онкологии, онкогинекологии и лаборатории иммуновдтохимии МНИОИ им. П.А.Герцена.

Материалы диссертации представлены в докладе «Основные причины ошибок цитологической диагностики рака некоторых локализаций» на Всероссийской научно-практической конференции «Диагноз через лабораторию» (Москва, 1993).

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 5 рзбот.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ

Диссертация изложена на ¡¿£>0 страницах машинописного текста, состоит из введения, 9 глав, заключения, выводов, указателя литературы, включающего / источников отечественной и зарубежной литературы. Текст иллюстрирован ^ таблицами, графиками и фотографиями.

МАТЕРИАЛ И МЕТОЛУ ИССЛЕДОВАНИЯ,

В основу работы положены материалы, полученные при использовании цитологического метода диагностики рака и нераковых заболеваний легких, средостения, пищевода, желудка, молочной железы, шейки и тела матки у 3893 больных, оперированных в МНИОИ им. П.А.Герцена с 1988 по 1992 годы. Всего выполнено II 365 цитологических исследований на этапах обследования больных и во время интраоперационной диагностики. Дня исследования были взяты подряд имевдиеся сведения обо всех оперированных больных. Характеристика материала представлена в таблице I.

Таблица I

Распределение материала в зависимости от локализации и характера патологического процесса

Локализация процесса

.’Нераковые поражения

Рак : злокачест-:доброкачественные :венные опу:опухоли, диспла-: холи :зии. воспаления

Легкие 2267 2083 66

Средостение 117 — 70

Пищевод 1695 1642 8

Желудок 1976 1868 57

Молочная железа 4620 4006 42

118 47 45 51 572

Шейка матки

3?9

290

89

Тело матки

311

243

II

52

ВСЕГО

11365 10137 254

974

89,19$

2,23$

8,58$

На этапе кооперационного обследования больных материалом для цитологического исследования были пунктаты, соскобы, отпечатки о биопсированных кусочков ткани из патологического очага, полученные при эндоскопическом исследовании различных органов. Во время операции исследовались также соскобы с удаленных кусочков тканей и лимфатических узлов, пунктаты инфильтратов, уплотнений, обнаруженных хирургом, соскобы с операционных разрезов.

Подробное цитоморфологическое изучение проводилось по окрашенным препаратам. Использовались методы окраски: по способу Паппенгейма, гематоксилин-эозином по Мейеру, катионовым синим основным .по методике Г.Н.Хайрутдиновой, по Цилю-Нильсену.

Анализ цитологических заключений проводился в соответствии с цитологическими классификациями, разработанными ВОЗ, СЭВ и ведущими научными онкологическими учреждениями России.

Критерием достоверности цитологических заключений во всех наблюдениях служили данные гистологического исследования операционного и биопсийного материала.

По результатам цито-гистологических сопоставлений все цитологические заключения разделены на правильные, ошибочные и описательные. К ошибочным мы относили все случаи расхождений цитологических заключений с гистологическими, вне зависимости от того, даны ли цитологические ответы в уверенной или предположительной форме. Ошибочные цитологические заключения делили на

ложноотрицательные — при раке и другой злокачественной опухоли, ложноположительные по раку и другой злокачественной опухоли — при незлокачественных процессах, расхождения по гистогенезу и гистологической форме опухоли, по специфике воспалительного процесса.

Для оценки практической значимости цитологического метода диагностики использовали показатели достоверности, эффективности, чувствительности, специфичности, а также тесты прогнозирования положительного и отрицательного результатов.

В качестве дополнительных методов диагностики для предупреждения цитологических ошибок в трудных диагностических случаях, наш изучены возможности использования морфометрического и им-муноцитохимического анализа цитологических препаратов.

Цитоморфометричаский метод исследования предусматривал измерения ядерно-цитоплазмеиного отношения (я/ц) с целью дифференциальной диагностики высокодиф^еренцированных аденокарцином от тяжелых дисплазий железистого эпителия. Изучены 25 наблюдений (15 — с диагнозом высокодифференцированный рак, 10 — тяжелая дисплазия), в которых имелось полное совпадение цитологических и гистологических данных и 28 наблюдений при высокодифференци-рованных зденокарцияомах и тяжелых дисплазиях желудка — 6, молочной железы — 15, эндометрия — 7, где имели место ошибки цитологической диагностики, как ложноотрицательные, так и ложно-положительные. Я/ц определяли с использование?л измерительной сетки для цито-гастостереометрических исследований у 50 клеток в каждом наблюдении. Опухолевые клетки распределяли по типам,’;, существенно различающимся по групповым средним величинам (от 0,30 ± 0,07 до 3,48 ± 0,80). Строили вариационные кривые распределения я/ц для высокодифференцированных карцином и диспла-стических процессов железистого эпителия, предполагая, что ва-

риационные кривые, полученные в наблюдениях о полным совпадением цитологических и гистологических данных могли бы служить эталонами для сравнения показателей я/ц при сложностях оценки материала.

Иммунодатохимичесний метод исследования проводили с целью выявления антигенов (равово-эмбрионального или бета-1-мекони-ального) в опухолевых клетках аоциоических и плевральных жидкостей при дифференциальной диагностике их с клетками мезотвлия на архивном окрашенном материале и текущем материале (150 мазков у 57 больных). Использовалась схема постановки иммуноцито-химической реакции в непрямом иммунопвроксидазном варианте. Реакция проводилась в лаборатории иммуноцитохимии МНИОИ им. П.А. Герцена (зав. — доктор медицинских наук Пугачев К.К.).

Анализ материалов, полученных в диссертации, показал, что ошибки цитологический диагностики на весь массив цитологических исследований составил 8,35$ (949 из II 365) (таблиц? 2).

Таблица 2

Результаты цитологической диагностики на весь массив проведенных исследований

. t

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Локализация . процесса

:Общее ; Цитологические заключения Гчисло :————■.• ………………

ошса тельные

Легкие Средостение

Млтглттиасг WQTTQOn

Пищевод Желудок

2267 1820 218 9,62 ^

117 ‘ ‘ 49 22 18,80

1695 1358 249 14,69

1976 1734 139 7,03

ЯЯВО 188 4.06

229 46 88

103 582

Шейка матки Тело матки

379 311

262 217

58 75

15,30 24,11

59 19

ВСЕГО:

II365

9290

949

8,35

1326

При раке средний показатель ошибок составил 7,14$, минимальное число их ошечено при раке молочной железы (2,89$), максимальное — при раке эндометрия (24,19$) (таблица 3). При нераковых поражэниях — доброкачественных и злокачественных неэпителиальных опухолях, дисплазиях эпителия и продуктивных воспалениях — цитологические ошибки отмечены в 2,6 раза чаще, чем при раке а составили 18,32$ (таблипц 3).

Таблица 3

Сведения об ошибках цитологической диагностики при раке и нераковых процессах

: иощее число ис-

Ошибочнне заключения

Локализация процесса : при ! :при не-• : раковых | при раке :при нераковых процессах

: раке :процес-«: сах 1абс. $ |абс. • <1 /о

Легкие 2083 184 162 7,78 56 30,43

Средостение — 117 — 22 18,80

Пищевод 1642 53 231 14,07 18 33,96

Желудок 1868 108 120 6,42 19 17,59

Молочная железа 4006 614 ‘116 2,89 72 11,72

Шейка матки 290 89 35 12,07 23 25,84

Тело матки 248 63 60 —л 724 24,19 15 23,80

ВСЕГО: I0I37 1228 7,14 225 18,32

В структуре ошибок цитологической диагностики при раке наибольшее чрсло приходится на долю ложноотрицательных ответов, составивших 76,65$ (555 из 724 ошибок) (таблица 4). Ложнопо-лояительные заключения 3,73$ были даны ери исследовании лимфатических «узлов, краев резекции и других объектов во время инт-раоперационной диагностики. Ошибки при определении гистогенеза опухоли и гистологической формы имели место в 19,64$ (в 142 исследованиях из 724).

Ложноположительные цитологические заключения о раке и другой злокачественной опухоли при доброкачественных процессах в общей отруктуре ошибок при этих заболеваниях составили 42,67$ (123 из 949). » _ :

Причины цитологических ошибок ¡систематизированы нами по трем основным группам: объективные, субъективные, технические; на долю первых приходится 39,5$, вторых — 21,2$, третьих —

39,3$. !

Объективные причины ошибок зависят от целей, которые ставиа перед собой цитолог:

I. При установлении цитологического диагноза рака они объяс няютоя:

— отсутствием патогномоничных критериев злокачественности клеток;

— многообразием цитологических картин различных гисгологиче ских форм рака и других злокачественных новообразований, отсутствием цитологических классификаций, отражающих это многообразие и недостаточной изученностью цитограмм опухолей оооудистого,» мышечного, нэйрогенного генеза, АПУД-сиотемы;

— трудностями интерпретации цитологических картин при дис-пластических процеосах в эпителии различных органов, ооо-

бенно при тяжелой дасплазии, сопровождающейся мета пластическими изменениями;.

— трудностями интерпретации цитологических картан продуктивных воспалительных процессов (в том-числе гранулема-тозных) о присутствием большого числа измененных мезен-химальных элементов, когда создается впечатление полиморфной цитологической картины, что может привести к ошибочному заключению о злокачественной неэштелиальной опухоли — саркоме;

— малыми размерами раковой опухоли, особенно развившейся

■ на фоне предопухолевых изменений или в сочетании с сопутствующим. воспалительным процессом, при отеке ткани органа, когда тлеются трудности получения материала из основного очага и в исоледуемый материал попадают только клетки сопутствующего процесса;

— стремлением цитолога дать цитологическое заключение по малому числу клеток.

2. При уточнении цитологом гистогенеза или гистологической формы рака:

— сходством цитологических картин некоторых низ’кодифферен-цированных раков о цитограммами при заболеваниях кроветворных органов;

— недостаточной изученностью цитологических картин редких гистологических форм рака и большинства злокачественных опухолей неэпигелиального генеза;

— наличием сопутствующего опухоли продуктивного воспалительного процесса, клетки которого могут оказаться.преобладающий в цнтограше.

Таблица 4

Структура ошибок цитологической диагностики при раке и нераковых процессах

Характер цитологических ошибок

при раке

: абс. :

%

при нераковых продав са*_

абс.

Ложно отрицательные по раку и друюи злокачественной опухоли

Ложноиоложительные по раку и другой злокачественной опухоли

Неверно определен гисто- -генез опухоли

Неверно определена гистологическая форма

Не определен характер воспалительного процесса

555

2?эе)

28 114

76,65

39

ИТОГО:.

724

к) — по лимфатическим узлам и другим объектам.

17,33

3,73 96 42,67

3,67 54 24,00

‘ 15,75 13 5,78

23 10,22

100,00 225 100,00

3. При определении степени распространенности рака по лимфатическим узлам: в серозных полостях, соскобах о операционных разрезов и другим объектам:

— трудностями дифференциальной диагностики клеток рака при метастазах в лимфатические узлы с клетками пролиферирую-щего .эндотелия, в жидкостях — клеток рака от клеток про-лиферируюцего мезотения;

— сходством цитограмм недифференцированных мелкоклеточных раков с гипершгазированными-элементами лимфатического узла

или,клетками лимфом.

%

Ошибки, вызываемые субъективными причинами, могут быть обусловлены:

— недостаточной профессиональной подготовкой врача, выполняющего цитологическое исследование;

— игнорированием цитологом сведений о течении болезни, клинических данных и результатах исследования других диагноста ческих методов; ,

— недостаточной онкологической подготовкой врача-клинициста, получающего материал для цитологического исследования;

— неправильной оценкой врачом-клиницистом цитологических заключений.

Технические причины связаны с

— неправильной обработкой жидкоотей из серозных полостей;

— нарушением процесса фиксации и окраски мазков.

Обобщение материалов по причинам цитологических ошибок при

раке позволило установить определенную универсальность этих причин, не зависящих от локализации процесса.

Универсальными причинами,»»М&ущими к лояноотриц тельным по раку заключениям, являются следущие:

1. Отсутствие в опухолевых клетках’большинства высокодиффе ренцированных раков достаточного набора визуальных признаков злокачественности клеток и сходством их с клетками пролифэриру зсщего эпителия данного органа.

2. Трудности интерпретации клеток скиррозных раков из-за их гиперхромии, единственным визуальным признаком злокачествен ности является резкий полиморфизм ядер.

3. Недооценка цитологами адгезивных свойств опухолевых кле ток — тенденции к разрозненному расположению их при раке, в от личзе. от тенденция пролиферирунцего эпителия располагаться в

плотных скоплениях; исключение составляют скиррозный и коллоидный рак с внеклеточной слизью, когда опухолевые клетка образуют плотные небольшие скопления.

4. Трудности,интерпретации цитограмм мелкоклеточного лим-фоцитоподобного рака, клетки которого ошибочно могут быть приняты за лимфоиднне элементы.

Универсальными причинами, ведущими к ложноположи-тельным цитологическим заключениям о раке при не раковых поражениях являются следунцие:

1 — трудности интерпретации цитограмм при тяжелой и умеренной дасплазиях.ищалия (ДП и ДШ) из-за присутствия клеток с признаками атипичности.

2 — трудности дианетики при продуктивных воспалительных процессах из-за полиморфной картины цитограммы и присутствия соединительнотканных элементов крупного размера.

Б результате подробного анализа о пересмотром препаратов всех выявленных цитологических ошибок за 1988-1992 годы, мы установили, что наиболее грацислальным путем, способствующим снижению числа ошибок, является создание дифференциально-диагностических схем*-¿-Такие схемы разработаны нами для диагностики рака к предусматривают характер ошибки, причины, связанные с особенностями-цию^рамм и признаки, способствующие уточнению цитологичвекогогдиагноза.

Апробация разработанных схем показала существенное влияние их на качество цитологической диагностики при раке (таблица 5).

Использование морфометрического исследования с определением ядэрно-цитоплазменного отношения (Я/Ц) позволило построить эталонные кривые распределения я/ц для высокодифференцирован-ных аденокарцином и тяжелых дисплазий. Сопоставление с эталонными кривыми кривых распределения я/ц при ошибках цитологической

Таблица 5

Результаты применения дифференциально-диагностических схем

Показатели

По первичным дан:При использовании НЕМ {%) : схем {%)

Эффективность 81,74 88,23

Достоверность 90,73 94,69

Чувствительность 93,79 96,79

Специфичность 88,22 95,50

Сравниваемые показатели статистическй^дОСТоверны (Т> 2, Р = 0,05). :

Тест прогнозирования положительного результата 98,59$ Тест прогнозирования отрицательного результата 61,82$

I

диагностики рака в 28 наблюдениях, дало возможность устранить ошибки 17 раз. Использование эталонных кривых позволяло судить о том, имела ли место истинная ошибка цитолога или расхождение цитологических и гистологических данных зависело от того, что материал взят из разных участков^ткани.

Применение иммуноцитохимической реакции, на текущем материале с целью выявления клеток рака в экссудатах из серозных полостей у 21 больного показало, что она- оказалась позитивной в 14 наблвдениях — во всех случаях при железистом раке; отрицательные результаты имели место при плоскоклеточных раках (3), в наблвдениях, где цитологом не было указано на присутствие клеток рака в мазках (3), ив одном наблюдении при’уверенном цитологическом заключении о специфическом раковом экссудате. На архивном материале (36 наблюдений с различными цитологическими’ заключениями по жидкостям), во всех 13¡случаях при цито-

граммах воспалительного и реактивного экссудатов данные им-муноцитохимической реакции были отрицательными. Отрицательной реакция оказалась и в 4 наблвдениях, где цитолог указывал на мезотелиому. Из 18 наблюдений, где в мазках имелись клетки железистого рака, иммуноцитохимичеокая реакция была позитивной в 7, а в 3 случаях сомнительной — из-за того, что в отмытых этиловым спиртом архивных мазках исследованию мешали арте-фактныв отруктуры — остатки предыдущей краски в глыбках хроматина и цитоплазме, и в 8 наблвдениях — отрицательной.

Таким образом, использование иммуновдтохимической реакции может способствовать устранению диагностических цитологических трудностей в сомнительных случаях, когда клетки рака при нерезкой атипик не расценены с уверенностью при обычной окраске, а цитологическое заключение носит предположительный характер.

На основании результатов наших исследований о использованием показателей тестов прогнозирования положительных и отрицательных результатов нами условно определены направления даль нейших поисков вероятностных возможностей для онижения числа ошибок (таблица 6).

Таблица 6

Вероятностные возможности снижения числа ошибок

Пути снижения числа ошибок : Проценты

Поиск дополнительных критериев злокачественности 6,2

Поиск дифференциально-диагностических

критериев 15,9

Создание цитологических классификаций 24,1 .

Дальнейшее изучение диспластических

процессов 9,3

гнификация технических приемов /’овершенствование забора материала 1овышение квалификации цитолога

9,0 4,8 13,9

[епреодолимые ошибки

16,8

ВСЕГО:

100,00

Процент непреодолимых ошибок достаточно высок и зависит,

I

ю нашему мнению, от пределов возможностей метода.

1. Цитологические ошибки при раке и нераковых поражениях чегких, органов средостения, пищевода, желудка, молочной же-тезы, шейки и тела матки составили на весь массив исследований 8,35$.

2. При раке цитологические ошибки имели место в 7,14$, максимальное число их — 24,19$ отмечено при раке эндометрия, «иншальное — 2,89 при £аке молочной жэлезы.

3. При нераковых поражениях — доброкачественных и злокачественных опухолях, дисплазиях эпителия и продуктивных воспалениях — цитологические ошибки отмечены значительно чаще, чем при раке, и составили 18,32$.

4. В структуре ошибок цитологической диагностики при раке на долю ложноотрицательных заключений приходится 76,65$; неверно определены гистогенез и гистологическая форда в 19,62$; в структуре ошибок при нераковых процессах ложноположительные заключения о раке составили 42,67$.

5.; Причины ошибок цитологической диагностики при рака и нераковых заболеваниях могут быть разделены на объективные, субъективные, технические: в общей структуре причин ошибок на

ВЫВОДЫ

их дояю приходится соответственно 39,5$; 21,2$ и 39,3$.

6. Объективные причины ошибок зависят главным образом от отсутствия патогномоничных цитологических признаков злокачественности клеток, что делает недостаточно обоснованный принципы цитологической диагностики, объясняет трудности, стоящие перед практическим врачом-цитологом и диктует необходимость поиска дифференциально-диагностических признаков.

, 7. Разработаны дифференциально-диагностические цитологические схемы, предусматривающие характер ошибки, причины, связанные с особенностями цитограмм, и признаки, способствувдие уточнению цитологического диагноза; использование схем повышает

показатели достоверности, эффективности, чувствительности и

■ ! *

специфичности цитологического метода соответственно до 94,69$, 88,23$, 96,79$, и 95,50$, вместо 90,73$, 81,74$, 93,79$ и 88,22$.

8. Установлен Универсальный характер ошибок при высокодиф-фарвнцированных аденокарциномах и тяжелых дисплазиях железистого эпителия при различных локализациях процесса; для дифференциальной диагностики в комплексе с цнтоморфологическим исследованием может быть применен морфометрический метод с использованием кривых распределения я/ц, разработанных для указанных заболеваний.

9, Позитивные результаты иммуноцитохимической реакции выявления раково-эмбрионального антигена в клетках аоцитических и плевральных жидкостей целесообразно использовать для поиска дополнительных цитоморфологических критериев, свидетельствующих о принадлежности клеток к раку; эти критерии помогут практическим вранам-цитологам улучшить результаты исследований в трудных для диагностики наблюдениях.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При проведении цитологических диагностических исследований с целью установления диагноза рака или неракового поражения легких, средостения, пищевода, желудка, молочной железы, шейки и тела матки необходимо учитывать возможность возникновения ошибок, вызываемых объективными, субъективными и техническими причинами.

2. Для снижения числа диагностических цитологических ошибок при раке основных локализаций целесообразно использовать дифференциально-диагностические цитологические схемы, в которых предусматривается характер ошибки, причины, связанные с особенностями вдтограмм и признаки, способствующие уточнению цитологического диагноза.

3. При трудностях цитологической дифференциальной диагностики высокодифференцированных железистых раков и тяжелых дис-плазий железистого эпителия в комплексе с цитоморфологическим исследованием окрашенных мазков целесообразно использовать мор-фометрическое определение ядерно-цитоплазменного отношения с помощью измерительной сетки для цитогастостереометрических исследований.

4. Целесообразно использовать иммуноцитохимический метод выявления раково-эмбрионального антигена в клетках асцитичес-ких и плевральных жидкостей, что улучшает диагностику специфических раковых экссудатов.

СПИСОК опубликованных работ по теме диссертации

1. Основные причины ошибок цитологической диагностики рака некоторых локализаций. — «Клиническая лабораторная диагностика», 1994, 2, 51-52. соавт. К.А.Агамова.

2. Основные причины ошибок цитологической диагностики рака легких и пищевода. — «Архив патологии», 1994 , 5. соавт. К.А.Агамова .

3. Цитологический метод в ранней диагностике рака — В сб. : «Ранняя диагностика онкологических заболеваний». M., 1994, 46-75. ооавт. К.А.Агамова, З.Д.Гладунова, Н.А.Сидорова, Е.Н.Славнова.

. 4. Ошибки цитологического исследования при ранней диагностике рака эндометрия — В сб.: «Ранняя диагностика онкологических заболеваний». M., 1994 , 75-78.

5. Irâmunocytochemical Detection of Carciuoembryonio Antigen in Problematic Serous Effusions «Acta cytplpgica», 4, 1994, p.654tt.^babaloa, K.Puguchev, I.Shimbireva).

Цитологический метод в диагностике опухолей и опухолеподобных процессов

Цитопатология, клиническая или диагностическая цитология, изучает клеточный состав патологических процессов. В качестве отдельной медицинской специальности официально признана в 1941 г. после работ Папаниколау Г. и Траута Н. К чести нашей страны разработка цитологического метода диагностики начата в 1938 г. в клинико-диагностической лаборатории Московского научно-исследовательского онкологического института им. П.А. Герцена. В 1941 г. профессор Н.Н. Шиллер-Волкова на сессии института доложила о первых результатах по исследованию выделений из влагалища, мокроты и пунктатов. В развитии цитологии можно выделить три основных этапа: эксфолиативная, в основном гинекологическая цитопатология; аспирационная цитология, бурный расцвет которой начинается с 80-х годов и связан с внедрением ультразвуковой диагностики, и современный этап развития определяется применением иммуноцитохимических и молекулярных методов исследования, а также автоматизированного скрининга в гинекологической цитологии.

Цитологический метод технически прост, быстр, сравнительно дешев, малотравматичен. Однако «легкость» цитологического метода обманчива, так как цитологическое исследование должно заканчиваться формулировкой заключения, основываясь на котором разрабатывается тактика лечения.

По способу получения материала цитологию можно подразделить на дооперационную (эксфолиативную, абразивную, аспирационную) и интраоперационную. Эксфолиативная цитология включает в себя исследование вагинальных мазков, мокроты, мочи, плевральной, перитонеальной, перикардиальной, цереброспинальной, синовиальной жидкости и т.д. Этот раздел цитологии отличается простотой техники получения большого количества различного типа клеток, в том числе воспалительного ряда. Клеточный материал может быть не очень хорошо сохранен. Для получения информативного материала с поверхности патологического очага удаляют гноевидные массы, корочки, некротический налет. Если полученный материал представляет жидкость, то в нее добавляется цитрат натрия, чтобы жидкость не свернулась.

Абразивная цитология получает материал из определенного участка внутренних органов, в том числе исследуются субэпителиальные поражения с помощью фиброоптических инструментов. При таком взятии материала клетки хорошо сохраняются, и препараты легко интерпретировать. Материал получают из шейки матки, вагины, эндометрия, респираторного, желудочно-кишечного, мочеполового тракта.

Тонкоигольная биопсия в настоящее время позволяет получить материал практически из любого органа. Метод постоянно совершенствуется и дает оптимальные результаты, что делает его в плане диагностики высокоэффективным и экономичным.

Взятый для цитологического исследования материал помещают на край предметного стекла и другим предметным или покровным стеклом равномерно, сильно не надавливая, тонким слоем распределяют по всей поверхности препарата.

В последние годы помимо рутинных цитологических мазков для получения качественных монослойных цитологических препаратов используется жидкостная система: пунктаты вносятся в специальную среду накопления, после чего центрифугируются в режиме 1000 оборотов в течение 5 минут при среднем ускорении на центрифуге (Суtospin-3, Суtospin-4). Применение методики жидкостной цитологии имеет ряд преимуществ: обеспечивает сохранность клеточных структур, уменьшает фон, клетки сосредотачиваются в одном месте – «окошке», что сокращает время просмотра препарата и значительно экономит дорогие сыворотки при проведении иммуноцитохимического исследова-
ния. Для создания архива и возможности последующего исследования материала используется методика Cell-block, при которой получаются препараты, занимающие промежуточное положение между цитологическими и гистологическими.

Влажная фиксация препарата в спирте сразу после взятия мазков применяется при окраске по Папаниколау. В остальных случаях мазки высушивают на воздухе, а затем фиксируют уже в лаборатории. Наиболее распространенный способ фиксации – в равных объемах спирта и эфира (смесь Никифорова). Для иммуноцитохимического исследования применяют фиксацию ацетоном. При окраске мазков используют панхромную окраску азур-эозином по методу Романовского – Гимза в различных модификациях (Лейшмана, Паппенгейма), а также окраска гематоксилином и эозином, особенно при исследовании гинекологического материала используется окраска по Папаниколау. Возможно при рутинном исследовании или специальной окраске выявление бактериальной флоры, в том числе бацилл Коха, лепры, хеликобактера, трихомонад и т.д.

Цитологическая диагностика основана на следующих принципах:

• Разница клеточного состава в норме и патологии.
• Оценка не одной отдельно взятой клетки, а совокупности клеток, большое значение придается фону препарата.
• Цитолог должен иметь патологоанатомический базис.
• Каждое исследование завершается формулировкой заключения.

Критерии цитологической диагностики злокачественных новообразований составляются из оценки клетки, ядра и ядрышка.

Клетка:

– увеличена в размере, иногда гигантская, редко размер близок к норме, что затрудняет цитологическую диагностику, например, при коллоидном, тубулярном раке, маститоподобном варианте долькового рака молочной железы, фолликулярном раке щитовидной железы, карциноиде, почечноклеточном светлоклеточном раке, высокодифференцированных веретеноклеточных саркомах;

– изменение формы и полиморфизм клеточных элементов;

– нарушение соотношения ядра и цитоплазмы в сторону увеличения доли ядра;

– диссоциация степени зрелости ядра и цитоплазмы, например, молодое ядро в ороговевшей цитоплазме при высокодифференцированном плоскоклеточном раке.

Ядро:

– увеличение размера, полиморфизм, бугристость, неравномерный рисунок хроматина, наиболее постоянный признак – неровность контуров, гиперхромия, фигуры клеточного деления в цитологических препаратах сравнительно редки.

Ядрышко:

– число ядрышек больше, чем в нормальной клетке, ядрышки увеличены в размере, неправильной формы.

Несмотря на присутствие критериев злокачественности у подавляющего большинства клеток, в некоторых клетках рака эти критерии могут отсутствовать или быть выражены в неполном объеме. Необходимо обращать внимание на особенности взаимного расположения клеток, характер межклеточных связей. Заключение формулируют по совокупности признаков при достаточном количестве клеточного материала. Попытка оценить мазок по неадекватно взятому материалу – наиболее частая причина ошибочных заключений.

Основные задачи цитологической диагностики состоят в следующем:

1. Формулировка заключения до лечения.
2. Интраоперационная срочная диагностика.
3. Контроль эффективности лечения.
4. Оценка важнейших факторов прогноза течения заболевания.

Цитологическое заключение до лечения включает:

• определение гистогенеза новообразований;
• установление степени дифференцировки опухолевого процесса;
• уточнение степени распространенности опухоли;
• изучение фоновых изменений;
• определение некоторых факторов прогноза;
• возможность исследования бактериальной флоры.

Современное цитологическое заключение не только констатирует наличие рака, но и указывает гистологический тип опухоли и степень дифференцировки согласно общепринятым международным классификациям (МКБ-О и ВОЗ).

Критериями достоверности цитологического метода являются результаты сопоставления с плановым гистологическим исследованием. Наибольший процент совпадений цитологического заключения с окончательным гистологическим заключением наблюдается при исследовании образований кожи, молочной, щитовидной железы, при метастатическом поражении лимфатических узлов. Результаты исследования гиперпластических процессов в эндометрии неудовлетворительны (достоверность 30–50%) и заставляют искать пути совершенствования диагностики. Достоверность цитологической диагностики патологии шейки матки составляет 75–90%. 3–24% исследований, в зависимости от локализации и способа получения материала, оказываются неудачными из-за неадекватно полученного, неинформативного материала.

Таблица 1. Достоверность цитологических исследований
опухолей различных локализаций.

Уверенное цитологическое заключение о наличии злокачественного новообразования, совпадающее с клиническими симптомами и данными других диагностических исследований, расценивается как морфологическое подтверждение диагноза злокачественной опухоли. Это предъявляет к цитологическому методу высокие требования и заставляет искать пути предупреждения возможных ошибок. По характеру ошибки цитологов можно разделить на две большие группы: ложноотрицательные и ложноположительные. Ложноотрицательные заключения преобладают и приводят к гиподиагностике опухолевого процесса, чаще всего из-за небольшого количества информативного материала в пунктате. Имеются и объективные трудности в оценке изменений, связанные чаще с высокой дифференцировкой опухоли, например, практически невозможно диагностировать фолликулярный рак щитовидной железы с минимальной инвазией, трудно диагностируется тубулярный, маститоподобная форма долькового рака молочной железы.

Гипердиагностика опухолей на нашем материале многие годы не превышает 1%, однако может служить причиной ненужного, а иногда и калечащего лечения. Истинная гипердиагностика, то есть ложное цитологическое заключение о наличии опухоли, объясняется несколькими наиболее типичными причинами.

Выраженная пролиферация клеточных элементов является наиболее частой причиной гипердиагностики рака. Например, пролиферация эпителия протоков и долек молочной железы при фиброаденоме и пролиферирующем аденозе, особенно при укрупнении ядер, наиболее часто приводит к гипердиагностике рака молочной железы. Правильной диагностике помогает анализ ядерных характеристик клеток опухоли: наличие ровных контуров ядра и равномерное распределение хроматина.

Реактивные изменения эпителия служат также нередкой причиной неадекватной цитологической диагностики. Наиболее тяжелые ошибки встречаются при ангиомиолипоме почки, при которой реактивные изменения почечного эпителия с укрупнением и полиморфизмом ядер приводят к ошибочному диагнозу высокодифференцированного почечноклеточного светлоклеточного рака. Диагностике ангиомиолипомы помогает обнаружение сосудистых структур и веретенообразных клеток, экспрессирующих виментин, десмин, НМВ-45.

Хронический аутоиммунный тиреоидит типа Хашимото сопровождается образованием сосочковоподобных структур, к оценке которых необходимо подходить осторожно и помнить, что при этом процессе реактивные изменения эпителия можно ошибочно принять за папиллярный рак щитовидной железы. Для хронических дерматитов, язв характерны атипические реактивные разрастания многослойного плоского эпителия, нередко представляющие непреодолимые трудности в дифференциальной диагностике с высокодифференцированным плоскоклеточным раком.
Выраженные дистрофические изменения клеток являются также одной из причин ошибочной цитологической диагностики. Например, выраженная жировая дистрофия гепатоцитов может привести к гипердиагностике метастаза почечноклеточного светлоклеточного рака, особенно при уже состоявшемся диагнозе рака почки.

Большую проблему цитологии представляет дифференциальная диагностика различных степеней диспластических изменений эпителия и внутриэпителиального рака. Присутствие при тяжелой дисплазии полиморфных крупных клеток с большими неправильно округлыми ядрами, иногда с увеличенными ядрышками, двуядерных клеток с тяжистым рисунком хроматина может быть неверно расценено как рак. При диспластических изменениях плоского эпителия необходимо учесть, что большинство клеток сходны с клетками глубоких слоев, крупные атипические клетки находятся в тесной связи с клетками без признаков атипии, имеются клетки стромы. Для объективизации дифференциальной диагностики различных степеней дисплазии и внутриэпителиального рака желательно проведение морфометрии клеток и ядер, что позволяет значительно снизить процент ошибочных заключений.

Нередко причиной гипердиагностики метастатического поражения в лимфатических узлах являются комплексы клеток укрупненного эндотелия и гистиоцитов, образующих эпителиоподобные структуры, а также наличие макрофагов с содержанием бурого пигмента. При затруднениях диагностики помогает иммуноцитохимическое исследование с небольшим набором антител (VIII фактор, цитокератины, ЭМА, НМВ-45), позволяющее подтвердить или отвергнуть наличие метастазов рака или меланомы.

Во избежание ошибок морфологической диагностики большое значение имеет четкое указание на характер проведенного лечения. Например, прием довольно распространенного антибиотика тетрациклина приводит к накоплению в клетках щитовидной железы бурого пигмента и ошибочному диагнозу метастаза меланомы. Прием мерказолила при зобе сопровождается резким полиморфизмом фолликулярного эпителия, что служит причиной цитологической и даже гистологической гипердиагностики фолликулярного рака. Проведение лучевой терапии вызывает выраженные изменения не только опухолевых клеток, но и нормального эпителия: укрупнение, полиморфизм клеток, патологическое ороговение, что является причиной гипердиагностики рака.

Имеются и объективные диагностические проблемы, например, в дифференциальной диагностике между эндометриоидной высокодифференцированной аденокарциномой и атипической гиперплазией эндометрия, себоррейной (базальноклеточной) кератомой и базально-клеточным раком, инфекционным мононуклеозом и болезнью Ходжкина, где достаточно высокий процент ошибочных заключений и требуется дальнейшая разработка цитологических критериев диагностики.

Знание клинической картины, характера проведенного лечения, применение современных методик морфологической диагностики с использованием иммуноцитохимии и морфометрии способствует сведению случаев гипердиагностики к нулю.

Вместе с истинной цитологической гипердиагностикой существует ложная гипердиагностика, когда цитолог дает уверенное заключение о злокачественном процессе, а при гистологическом исследовании опухоли не обнаруживается, то есть фактически имеет место гистологическая гиподиагностика. Пересмотр цитологических препаратов несколькими высококвалифицированными специалистами, повторное взятие биопсии, клиническое течение заболевания в дальнейшем подтверждают результаты цитологического исследования. Больше всего ложной цитологической гипердиагностики относится к исследованию биопсийного материала из бронхов и гортани, а также при исследовании лимфатическиих узлов, когда при цитологическом исследовании выявлялись единичные комплексы анаплазированных клеток, несомненно принадлежащих раку. При приготовлении гистологических препаратов эти комплексы теряются в готовых гистологических препаратах. Реальная потеря немногочисленных опухолевых клеток при приготовлении гистологических препаратов не допускает игнорирования клиницистом данных цитологического исследования и приводит к «золотому» стандарту – совместному цитологическому и гистологическому исследованию биоптата.

Интраоперационная цитологическая диагностика – одно из основных направлений цитологического метода исследования. Во время операции, используя цитологический метод, уточняется характер патологического процесса, степень распространенности с выявлением метастазов в лимфатические узлы, печень и другие органы, производится контроль радикальности выполненной операции с исследованием краев резекции. Роль цитологии возрастает при разработке показаний к расширенным лимфоаденэктомиям и при определении так называемых «сторожевых», или «сигнальных», лимфатических узлов, которых может быть шесть, и применение гистологического метода невозможно из-за длительности исследования. По данным ведущих клиник, ошибка срочного гистологического исследования «сторожевых» лимфатических узлов составляет 25%, поэтому они рекомендуют использовать интраоперационное цитологическое исследование отпечатков с поверхности разрезанного лимфатического узла. По нашим данным, достоверность срочного цитологического исследования по выявлению метастатического поражения лимфатических узлов составляет 97-99%.

Надо отметить, что к срочному морфологическому исследованию могут быть противопоказания. Срочное интраоперационное морфологическое исследование не рекомендуется выполнять при подозрении на внутриэпителиальный рак с ограниченным очагом поражения из-за того, что не останется материала для планового гистологического исследования. Цитологические критерии внутриэпителиального рака только разрабатываются, и цитолог может дать заключение о раке, не указывая, что это Carcinoma in situ. При внутрипротоковых папилломах небольшого размера срочное гистологическое исследование лучше не выполнять, а цитологическое исследование достоверно поможет установить характер процесса.

При срочной морфологической диагностике существенно помогает макроскопическое исследование операционного материала. Опытный морфолог при визуальном исследовании уже может поставить диагноз, но для подтверждения диагноза необходимо микроскопическое исследование. Например, опухолевый узел классической звездчатой формы может быть при трех совершенно разных процессах: при раке, склерозирующем аденозе с центром Семба и липогранулеме. И только микроскопическое исследование позволяет правильно поставить диагноз.

Цитологический метод позволяет в динамике, не травмируя пациента, изучать лечебный патоморфоз при химиолучевой и фотодинамической терапии.

XX столетие названо в медицинских кругах веком цитопатологии. Оценивая возможности цитологического метода, можно сказать, что есть еще возможности его развития в комбинации с другими дисциплинами и методами.

Иммуноцитохимическое исследование нередко является решающим в дифференциальной диагностике новообразований, когда при рутинном исследовании возникают непреодолимые трудности для установления гистогенеза отдельных опухолей, определения источника метастазирования, трактовки первично-множественных поражений.

За последние годы достигнут огромный прогресс в клиническом использовании различных биологических маркеров. В отличие от сывороточных маркеров, клеточные маркеры определяются непосредственно в опухолевых клетках ИЦХ исследованием, в основе которого лежит реакция антиген-антитело. В их числе онкогены, рецепторы эстрогенов и прогестерона, молекулы, опосредующие апоптоз, рецепторы факторов роста и т. д. Все эти показатели позволяют более детально изучить молекулярно-биологические особенности опухолевых клеток, ассоциированные со степенью дифференцировки, способностью к инвазии и метастазированию, чувствительностью к химиотерапии, и, следовательно, с особенностями течения и прогнозом заболевания в каждом конкретном случае.

Специфических маркеров дифференциальной диагностики злокачественных и доброкачественных опухолевых процессов не существует, но на сегодняшний день активно ведутся научные изыскания в решении этой проблемы. Так, равномерное окрашивание герминативных центров лимфоидных фолликулов с использованием антител bcl-2 указывает на фолликулярную лимфосаркому, в то время как негативная реакция свидетельствует о доброкачественном гиперпластическом процессе; реакция с антителами HBME-1 при ИЦХ исследовании опухолей щитовидной железы часто положительная в злокачественных новообразованиях и практически отсутствует при доброкачественных, в дифференциальной диагностике широко применяют галектин-3, экспрессирующийся карциномами щитовидной железы из А-клеток (папиллярный, фолликулярный) с отсутствием экспрессии в фолликулярных аденомах, зобах и нормальной ткани щитовидной железы.

Для установления гистогенеза и дифференциальной диагностики опухолей разработаны и постоянно совершенствуются, схемы C.R.Taylor и R.J. Cote (1994 г.). Разнообразие моноклональных антител, используемых в иммуноцитохимических исследованиях тонкоигольных пунктатов, в каждом конкретном случае позволяет ответить на вопрос, имеет ли данная опухоль эпителиальное происхождение или является саркомой, меланомой, лимфомой. Иммуноцитохимия широко применяется для иммунофенотипирования злокачественных лимфом, без чего, по современным канонам, невозможно начать лечение.

Иммуноцитохимическое исследование помогает в определении источника метастазирования при невыявленном первичном очаге. К сожалению, органоспецифических маркеров не так уж и много. К их числу могут быть отнесены специфический антиген предстательной железы (ПСA), позволяющий идентифицировать метастазы рака простаты более чем в 95% случаев; тиреоглобулин, экспрессирующийся в 92–98% фолликулярного и папиллярного рака щитовидной железы, и кальцитонин, экпрессирующийся в 80% медуллярных раков щитовидной железы В некоторых случаях рак щитовидной железы может экспрессировать и кальцитонин, и тиреоглобулин, что только с помощью иммуноферментной диагностики позволяет диагностировать диморфные А-С-клеточные раки.

Одним из первых показателей, вошедших в практику лечения больных раком молочной железы (РМЖ), и относящихся к категории клеточных маркеров, были рецепторы стероидных гормонов. Рецепторы стероидных гормонов – это белки, специфически и избирательно связывающие соответствующие стероиды после их проникновения в клетку.

По данным ВОЗ (2003 г.), экспрессия рецепторов эстрогенов (РЭ+) и прогестерона (РП+) в инвазивных протоковых раках составляет 70-80%; инвазивный дольковый рак в 70-95% экспрессирует РЭ, в 60-70% -РП, 100% экспрессия РЭ отмечена в инвазивном криброзном, муцинозных опухолях молочной железы. Эдокринная терапия наиболее эффективна у больных с первичными опухолями с высоким уровнем рецепторов стероидов. При метастатических поражениях степень реакции на эндокринную терапию также зависит от наличия РЭ и РП в опухоли: её эффективность составляет около 10–15% при гормонотрицательных опухолях, 27% при опухоли с РЭ+ и РП-, 46% при статусе РЭ- и РП+ и 75% при опухолях, содержащих РЭ+ и РП+. Рецепторположительные опухоли молочной железы имеют более высокую дифференцировку и более благоприятный прогноз.

Необходимо отметить, что рецепторы гормонов в доброкачественных образованиях молочной железы еще мало изучены. Отмечено повышение числа РЭ+ клеток в нормальной ткани молочной железы с увеличением возраста, а также при склерозирующем аденозе, папилломах, фиброаденомах и листовидных опухолях. Коэкспрессия РЭ+/Ki-67+ с разной степенью выраженности и соотношения большей частью выявлялась в патологии, связанной с риском развития РМЖ.

Рецепторы эстрогенов экспрессируются в клетках рака эндометрия, яичников, шейки матки, щитовидной железы, кишечника, нейроэндокринных опухолей, в том числе карциноидов.

Иммуноцитохимическое исследование позволяет на дооперационном этапе установить важнейшие факторы прогноза опухолевого процесса и скоррегировать схемы лечения. Пролиферативная активность многих новообразований оценивается с помощью антител Ki-67 в злокачественных лимфомах, опухолях молочной, предстательной, поджелудочной железы, легких, гипофиза, толстой кишки. Обнаружена связь между значениями индекса пролиферации и степенью гистологической дифференцировки опухоли и клиническим прогнозом при раке эндометрия, яичников, легкого, молочной железы, мочевого пузыря, лимфомах, опухолях нервной системы.

Гиперэкспрессия онкопротеина C-erbB-2(HER2/neu), являющегося рецептором эпидермального фактора роста 2-го типа, придающего клеткам свойство неограниченного деления, служит фактором риска рецидива заболевания для ряда опухолей: рака молочной железы, толстой кишки, лёгкого и др. Экспрессия онкобелка C-erbB-2 при ИГХ исследовании обнаруживается в 15–40% РМЖ. Выявление онкопротеина C-erbB-2, по мнению некоторых авторов, ассоциируется с высокой степенью злокачественности опухоли, отсутствием РЭ и РП, высокой митотической активностью, устойчивостью к химиотерапии и требует назначение герцептина.

Наличие метастазов в лимфатических узлах при опухолевом поражении является главным дискриминирующим прогностическим признаком. С помощью иммуноцитохимического исследования можно выявить единичные циркулирующие кератин-положительные клетки РМЖ в костном мозге и периферической крови. Применение ИЦХ исследования повышает выявляемость микрометастазов в лимфатических узлах на 3,2–24%.

Иммуноцитохимические реакции оцениваются как качественно при уточнении гистогенеза опухоли, наличии метастаза в лимфатическом узле или другом органе, иммунофенотипировании лимфом, так и количественно – при оценке пролиферативной активности, экспрессии рецепторов гормонов в опухоли, онкопротеина С-erbB-2 и т.д. Иммуноцитохимическая реакция может быть ядерной, цитоплазменной и мембранной. Ядерная реакция проявляется интенсивным окрашиванием ядра и бывает при определении РЭ и РП, Ki–67, PCNA, p53 и т.д. Цитоплазменная реакция характеризуется диффузным окрашиванием цитоплазмы или отложением гранул в виде грубых пятен и зерен. Цитоплазменное окрашивание дают хромогранин, синаптофизин, белок S-100, виментин, десмин, тиреоглобулин, кальцитонин, цитокератины, bcl-2 и т.д. Оценка этой реакции требует большой осторожности и контроля, так как фоновое окрашивание цитоплазмы клеток может быть принято за истинную реакцию. Мембранное окрашивание наблюдается при проведении реакции с онкопротеином C-erbB-2 и ЭМА (эпителиальным мембранным антигеном). Окрашивание в таких случаях только цитоплазмы не должно учитываться как экспрессия антигена. Маркер крупноклеточной анаплазированной лимфомы CD-30 может экспрессироваться как в цитоплазме, так и на мембране клетки.

Для количественной оценки экспрессии маркера Мс. Carthy и соавторы разработали систему подсчета Histo score (H.S.). Система подсчета включает интенсивность иммуноцитохимической окраски, оцениваемую по 4-балльной шкале, и долю окрашенных клеток и представляет собой сумму произведений процентов, отражающих долю клеток с различной интенсивностью окраски на балл, соответствующий интенсивности реакции. Интенсивность окраски в баллах: 0 – нет окрашивания, 1 – слабое окрашивание, 2 – умеренное окрашивание, 3 – сильное, 4 – очень сильное окрашивание. Формула подсчета:

Histochemical score = ∑ P(i)×i (гистосчет),

где i – интенсивность окрашивания, выраженная в баллах от 0 – 4,
Р(i) – процент клеток, окрашенных с разной интенсивностью.

Максимальное количество Histo score соответственно должно быть 400. Подсчет проводится в трех когортах по 100 опухолевых клеток в различных полях зрения (объектив х 40).

В практической работе допустимо использование полуколичественной оценки. Реакция считается отрицательной при полном отсутствии или экспрессии антигена менее 5%–10% опухолевых клеток, слабоположительной – от 5%–10% до 24% клеток, умеренно положительной – в 25%–75%, выраженной – более чем в 75% клеток. При оценке иммуноферментной реакции принимают во внимание интенсивность и полноту окрашивания цитолеммы клеток в центре опухолевого очага. Так, яркая, мембранная, беспрерывная по контуру клетки реакция обозначает выраженную экспрессию белка С-erbB-2 (+++), что в 95% случаев подтверждается амплификацией гена С-erbB-2, выявляемой с помощью FISH (флуоресцентной гибридизацией in situ).

Сопоставляя данные иммуноцитохимических исследований различных опухолей с целью уточнения гистогенетической принадлежности и результатов послеоперационных морфологических заключений, получены следующие результаты: 89% совпадений при анализе опухолей щитовидной железы, 83% при уточнении гистогенеза первичной опухоли и метастазах в лимфатических узлах, 89% – при опухолях мягких тканей и кожи и 100% – при исследовании биологических жидкостей. При определении гормонального статуса РМЖ процент совпадения ИЦХ и ИГХ исследований составляет 88,3%, при исследовании пролиферативной активности – 83%, при определении онкопротеина C-erbB-2 – 93,2%.

При сравнении возможностей ИЦХ исследования при выполнении пункционной биопсии и ИГХ исследования при трепанобиопсии преимущества ИЦХ, на наш взгляд, несомненны. Пункционная биопсия – более простая процедура, не сопровождается такими осложнениями, как воспаление, кровотечение, и позволяет получить полноценный клеточный материал. При неудачной пункции и попадании в некроз, строму опухоли, окружающие ткани можно практически безболезненно повторить процедуру. Кроме того, отсутствует потеря и маскировка антигенов при проводке и депарафинизации материала с использованием агрессивных химических реагентов.

Использование иммуноцитохимического исследования позволяет расширить возможности морфологических методов и на дооперационном этапе уточнить гистогенез, диагностировать первично-множественные поражения, степень распространения и оценить некоторые показатели прогноза и чувствительность опухоли к химиогормонотерапии.

На современном этапе развития в цитологии используются методы молекулярной и генной диагностики: гибридизация in situ, Southern Blotting, Nothern Blooting, Western Blotting, DNK Microarray и т.д) В научной и практической работе цитологи применяют проточную цитофотометрию.

Одним из путей совершенствования цитологического метода исследования является применение морфометрии, что позволяет получать объективные количественные параметры. Например, при обработке на компьютере выделены наиболее информативные морфометрические признаки, относящиеся к параметрам ядра с использованием основных диагностических морфометрических признаков: площадь, периметр, оптической плотности, коэффициент поляризации ядер, числа ядрышек, их площади и периметра. Разработаны объективные морфометрические признаки различных степеней дисплазии при дисгормонально-гиперпластических процессах молочной железы, шейки матки, что уменьшило долю субъективизма в определении различных степеней дисплазии.

Развиваются новые методы микроскопии: фазово-контрастная, флюоресцентная, конфокальная и т.д. Создание компьютерных систем обучения, развитие метода телеконсультации также предъявляют новые требования и, несомненно, будут способствовать развитию и совершенствованию цитологического метода диагностики.

Волченко Надежда Николаевна
д.м.н., профессор, руководитель отделения
онкоцитологии МНИОИ им.П.А.Герцена